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多形性胶质母细胞瘤（Glioblastomamultiforme,GBM）是成年人最常见、恶性程度最高的原发性脑肿瘤。新诊断的胶质母细胞瘤的标准治疗方法是在最大程度肿瘤切除后口服替莫唑胺（temozolomide,TMZ）联合放疗,但是5年总生存率仅约为5%。另外,胶质母细胞瘤现有的靶向治疗显示出有限的疗效。因此,寻找特异性高、敏感性强的新治疗靶点一直是胶质母细胞瘤极为重要的研究方向。铁死亡是一种铁离子依赖的氧化性细胞死亡形式。SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸逆向转运体关键蛋白,其作用为摄取胱氨酸合成谷胱甘肽（Glutathione,GSH）,中和活性氧（reactive oxygen species,ROS）和过氧化的脂质,抑制铁死亡。Erastin和柳氮磺胺吡啶（suffasalarin,SAS）可通过抑制SLC7A11蛋白功能,干扰胱氨酸摄取,从而诱导细胞铁死亡。iFSP1是一种有效的FSP1抑制剂,据报道可在谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4,GPX4）敲除细胞中诱导细胞铁死亡。近年来,以铁死亡机制为基础的癌症治疗方法引起了广泛关注。研究发现,铁死亡的诱导药物对胶质母细胞瘤治疗有积极作用,其不仅能直接杀死肿瘤,而且可以提高肿瘤对放化疗的敏感性。然而,与其他治疗方法一样,胶质母细胞瘤可以产生铁死亡诱导药物的耐药性,限制了铁死亡相关疗法的应用和发展。因此,探索肿瘤细胞对铁死亡抵抗能力的干预措施具有巨大的临床价值。NF-kB激活蛋白（NF-kB activating protein,NKAP）是一种进化上保守的核蛋白,主要作为RNA结合蛋白和转录抑制因子发挥作用,参与许多生理过程和疾病。最近一项研究表明,NKAP在miRNA加工和成熟过程中充当m6A reader,促进胰腺癌的进展。梅奥诊所和宾夕法尼亚大学的联合研究小组报道Treg细胞和造血干细胞中NKAP的缺失会诱导细胞死亡;最吸引我们的发现是,NKAP基因敲除导致幼稚T细胞的脂质过氧化水平升高,该成果与我们对胶质母细胞瘤的研究结果相似。2019年,我们报道NKAP是胶质母细胞瘤的促癌基因,然而,NKAP缺失导致胶质母细胞瘤细胞死亡的原因尚不清楚。本研究拟从体内、体外两个方面探究NKAP在胶质瘤细胞铁死亡中发挥的作用和机制。第一部分:NKAP在调控胶质母细胞瘤铁死亡进程中的作用探究研究目的干预NKAP基因表达,探究NKAP在调控胶质母细胞瘤铁死亡进程中发挥的作用。研究方法构建U87MG、U251细胞系NKAP基因敲低和过表达细胞模型,探究NKAP对胶质母细胞瘤细胞铁死亡的影响;RT-qPCR、Western Blot检测NKAP基因的表达程度;CCK-8细胞生存实验、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDH）释放实验、Live/Dead染色、流式凋亡评价细胞存活情况;脂质过氧化探针C11-BODIPY流式定量检测、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量检测、电镜观测、线粒体膜电位检测铁死亡相关指标。构建裸鼠胶质母细胞瘤原位和异位移植模型,探究体内环境中NKAP与胶质瘤对铁死亡诱导剂敏感性的关系。小动物活体成像技术、取材测量的方法评估肿瘤生长状态、大小。研究结果:1、NKAP敲低及过表达细胞模型构建通过慢病毒构建shRNA-NKAP干扰病毒和Lv-NKAP过表达病毒,Western Blot显示基因敲低和过表达效率高。2、NKAP基因敲低诱导细胞铁死亡NKAP基因敲低后肿瘤细胞生存减少,死亡增加,LDH释放增加,流式凋亡中第四象限细胞数减少;流式免疫标记显示C11-BODIPY阳性细胞比例明显增加,MDA含量增加,电镜发现线粒体变小、深染、部分细胞膜破裂、无染色质凝聚,线粒体膜电位降低;以上结果可被铁死亡抑制剂ferrostatin-1或alpha-tocopherol逆转。3、NKAP与肿瘤细胞对铁死亡诱导剂敏感性的关系CCK-8细胞毒性实验显示NKAP敲低会增加肿瘤细胞对铁死亡诱导剂敏感性,NKAP过表达会降低肿瘤细胞对铁死亡诱导剂敏感性。4、裸鼠胶质母细胞瘤原位和异位移植模型构建成功实验裸鼠随机分组,通过脑立体定位注射U87MG细胞悬液的方法构建胶质母细胞瘤原位异种移植模型,通过腋窝皮下注射的方法构建异位异种移植模型。5、体内环境中NKAP与胶质母细胞瘤对铁死亡诱导剂敏感性相关NKAP低表达的肿瘤组织对铁死亡诱导剂柳氮磺胺吡啶敏感性增加,肿瘤荧光强度低、体积较小;NKAP高表达的肿瘤组织对柳氮磺胺吡啶抵抗能力强,肿瘤荧光强度高、体积较大。第二部分:NKAP通过下游基因SLC7A11调控铁死亡进程的研究研究目的探究NKAP通过下游关键基因SLC7A11调控胶质母细胞瘤细胞铁死亡进程。研究方法铁死亡阵列、RT-qPCR、Western Blot、细胞免疫荧光、免疫组织化学、临床数据库生信分析筛选、评估NKAP下游基因;构建SLC7A11敲低及过表达模型,评估细胞生存及铁死亡的研究方法同第一部分;双转实验验证NKAP调控铁死亡的功能可以被SLC7A11基因干预逆转。研究结果:1、筛选NKAP下游关键铁死亡相关基因铁死亡阵列筛选出44个与NKAP表达关系密切的铁死亡相关基因,根据差异系数和P值筛选出SLC7A11是与NKAP关系最为密切的铁死亡效应基因。2、NKAP与SLC7A11的表达呈正相关NKAP与SLC7A11的表达在胶质瘤细胞、组织、临床样本数据库中均呈现正相关。3、SLC7A11基因敲低和过表达模型构建成功通过小干扰RNA构建siSLC7A11序列,另外构建过表达SLC7A11的质粒,基因敲低和过表达效率高。4、敲低SLC7A11诱导胶质瘤细胞铁死亡SLC7A11基因干预的结果与NKAP相似,敲低SLC7A11诱导胶质瘤细胞铁死亡,可被铁死亡抑制剂ferrostatin-1或alpha-tocopherol逆转。5、双转验证实验证明SLC7A11能逆转NKAP的功能过表达SLC7A11能逆转NKAP敲低导致的细胞铁死亡,也可逆转其导致的肿瘤细胞对铁死亡诱导药物的敏感性增强。第三部分:探究NKAP调控SLC7A11的分子机制研究目的探究NKAP以m6A依赖性方式调控SLC7A11表达进而抑制铁死亡的分子机制。研究方法使用m6A抑制剂环亮氨酸cycloleucine和小干扰RNA敲低m6A writer METTL3的方法探究m6A甲基化修饰在NKAP调控SLC7A11过程中的作用;m6A测序、RIP-qPCR、Co-IP等实验手段探究NKAP是m6A甲基化修饰的reader并直接结合SLC7A11 pre-mRNA上的m6A甲基化位点;转录组测序可变剪接分析、Co-IP-质谱、Western Blot等方法探究NKAP对SLC7A11 pre-mRNA剪接过程的影响和机制。研究结果1、干扰细胞整体m6A水平能阻碍NKAP对SLC7A11的调控作用m6A 抑制剂 cycloleucine 和 m6A writer METTL3 基因敲低能抑制 NKAP 对 SLC7A11的调控作用。2、NKAP是m6A甲基化修饰的readerm6A测序发现U87MG细胞中m6A甲基化位点的基序（m6A consensus motif）为“RGACH”,NKAP-iCLIP数据的生信分析发现NKAP对RNA的识别基序（NKAP footprints）为“RGAC”（R=A/G,H=A/U/C）,两种基序可重合说明二者存在直接结合的潜能,并分析了潜在的结合位点;RIP-qPCR、Co-IP实验结果表明NKAP与SLC7A11 pre-mRNA直接结合。3、NKAP通过调控SLC7A11 pre-mRNA可变剪接过程促进其成熟NKAP影响SLC7A11 pre-mRNA最后一个外显子可变剪接事件（alternative transcription termination site,TTS）;NKAP结合m6A修饰后通过招募脯氨酸/谷氨酰胺富含性剪接因子（splicing factor proline-and glutamine-rich,SFPQ）调控剪接事件;NKAP敲低增加SLC7A11 pre-mRNA/mRNA比例,促进其成熟。研究结论:1、NKAP基因敲低导致胶质母细胞瘤细胞发生铁死亡。2、NKAP基因过表达增强了细胞对铁死亡诱导剂的抵抗能力。3、体内环境下,NKAP基因敲低降低了肿瘤对铁死亡诱导药物治疗的抵抗能力。4、SLC7A11是铁死亡调控铁死亡的关键下游基因。5、NKAP 作为 m6A Reader,直接结合在 SLC7A11 pre-mRNA 的 m6A 位点上。6、NKAP结合m6A后通过招募剪接因子SFPQ,影响SLC7A11 pre-mRNA最后一个外显子可变剪接事件,促进其成熟。