一、背景与目的黄酮类化合物是一类在自然界广泛分布,具有生物活性的多酚类物质,在人类日常饮食中多有摄入。黄酮具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等药理活性,数十年来一直作为潜在的疾病预防和治疗药物而受到科学家的关注。但是仅少数黄酮类化合物作为抗肿瘤药物进入临床试验。黄酮类化合物的成药性受到两个问题的制约:尚未完全阐明的药效机制以及广泛的药物代谢造成的低生物利用度。黄酮分子上具有多个未结合的酚羟基,极易受II相代谢酶,如葡萄糖醛酸转移酶(UGT)和磺酸转移酶(SULT)催化发生II相结合反应,这已被证明是黄酮类化合物的主要代谢途径。许多黄酮的葡萄糖醛酸和磺酸结合物是肠和肝细胞膜上丰富表达的外排转运蛋白的底物。这些转运蛋白包括乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和多药耐药相关蛋白(MRPs),它们可将药物及其代谢物外排出细胞,是药物体内消除的重要组成部分。山奈酚,3,4’,5,7-四羟基黄酮,属于黄酮醇类,广泛分布于众多可食用植物和饮品中(如西红柿,花椰菜,蜂蜜,茶等)。据估山奈酚在人类日常饮食中的摄入可达4 mg/天。山奈酚是具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种药理作用。流行病学研究表明日常饮食摄入山奈酚可预防多种癌症发生,如胰腺癌,肺癌,卵巢癌和大肠腺瘤。其抗癌作用与影响肿瘤血管生成,干扰肿瘤细胞代谢,上调抑癌基因表达,诱导肿瘤细胞凋亡等有关。尽管药理研究众多,山奈酚的体内暴露研究却很少。山奈酚体外代谢研究表明大鼠CYP1A1可催化山奈酚的氧化代谢,代谢产物是槲皮素,但山奈酚更容易发生UGT代谢。在大鼠肝微粒体催化下山奈酚-7-葡萄糖醛酸苷(K-7-G)是主要的代谢产物,而小肠微粒体可生成较多的山奈酚-3-葡萄糖醛酸苷(K-3-G)。细胞实验报道山奈酚可能是P-gp和BCRP的底物或抑制剂。山奈酚可在Caco-2细胞内发生II相结合,随之被转运入单层细胞的底侧膜(BL面),或被外排到顶侧膜(AP面),但负责代谢产物转运的外排转运蛋白仍不明确。山奈酚的生物利用度不足2%。尽管已有LC-MS/MS方法应用于血浆中山奈酚的测定,但该方法定量血浆中总葡萄糖醛酸苷需要用葡萄糖醛酸酶将血浆中代谢物水解为原型来测定。此外,检测的灵敏度不高,血浆用量大,导致采血量多。山奈酚易被II相代谢,但山奈酚的体内处置情况,暴露形式及相关调控机制鲜有研究。充分认知黄酮体内处置过程对于阐明黄酮的药效作用和显效机制具有重要意义。为更好地了解山奈酚的药理性质,需要对其体内处置过程有一个全面而深入的研究,这也可对其成药性研究提供参考。在本论文中,我们采取了体内、体外和在体多种实验模型对山奈酚的体内暴露形式、水平和调控机制作深入探讨。首先我们建立了一个同时检测山奈酚原型和主要II相代谢产物的灵敏可靠的LC-MS/MS方法。运用此方法,我们进行了山奈酚口服给药SD大鼠药代动力学实验,了解山奈酚体内暴露形式和药动学性质。随后,通过转运蛋白基因敲除小鼠上的药代动力学探究外排转运蛋白P-gp、BCRP、MRP1和MRP2在调控体内山奈酚结合物暴露水平中的作用。大鼠在体肠灌流模型和体外代谢用来研究山奈酚在四肠段和肝中的吸收代谢,以解释山奈酚在肠和肝中的处置如何影响体内暴露。Caco-2单层细胞转运模型联合外排转运蛋白特异性抑制剂以进一步确认外排转运蛋白的作用。在高表达UGT1A9和UGTIA1的HeLa细胞上的药物处置过程阐明了 UGT-BCRP偶联对山奈酚代谢的调控作用。二、实验方法1.山奈酚II相代谢产物质谱方法的建立以UPLC-DAD-QTOF为工具,通过高分辨分子量和质谱裂解信息鉴定了山奈酚经大鼠肝微粒体催化的UGT代谢产物和肝S9催化的SULT代谢产物,通过紫外最大吸收波长漂移法和比对对照品保留时间确定II相代谢的羟基取代位置。随后我们建立了同时检测原型和代谢物的UPLC-MS/MS方法。2.SD大鼠和转运蛋白基因敲除小鼠的药代动力学山奈酚灌胃给药SD大鼠(10 mg/kg和20mg/kg),在预定时间点从眼底静脉取血。山奈酚灌胃给药基因敲除和野生型FVB小鼠(10 mg/kg),在预定时间点断尾取血。血浆样品经有机试剂萃取和蛋白沉淀后进样。用WinNonlin?3.3非房室模型计算药动学参数。3.山奈酚大鼠在体肠灌流和体外代谢采用大鼠在体肠灌流模型,山奈酚灌流浓度为5 和10 μM。收集灌流液,胆汁和血浆样品并分析。使用大鼠肝肠组织制备的微粒体或S9片段与山奈酚在II相体系中共孵育。4.山奈酚在Caco-2和HeLa-UGT细胞模型上的代谢和代谢产物外排在Caco-2细胞转运板的AP面或BL面加入山奈酚HBSS溶液,分别研究药物AP to BL和BL to AP两个方向的转运。P-gp抑制剂维拉帕米,BCRP抑制剂Ko143,MRP2抑制剂LTC4加于AP面,BL面MRPs抑制剂MK571加于BL面与山奈酚共孵育。样品采集于转运孔两侧。不同浓度的山奈酚给药于培养好的HeLa1A9和HeLa1A1细胞六孔板,抑制剂组加入不同浓度的Ko143共孵育,样品采集于细胞内外。三、结果与讨论1.山奈酚II相代谢产物的鉴定通过UPLC-DAD-QTOF鉴定了四个山奈酚单葡萄糖醛酸苷和一个山奈酚单磺酸酯。葡萄糖醛酸苷按洗脱顺序分别为K-5-G,K-3-G,K-7-G和K-4’-G,磺酸酯的取代位置为7位。K-3-G,K-7-G和K-7-S的对照品通过不同方法获得。2.山奈酚的体内暴露特征和外排转运蛋白的调控作用口服给药后,山奈酚在胃肠道快速吸收并被迅速转化为II相代谢产物,包括两个葡萄糖醛酸苷和一个磺酸酯,即K-3-G,K-7-G和K-7-S。与代谢物相比,山奈酚原型的量很低。山奈酚和葡萄糖醛酸苷在30 min内达峰并在12 h内完全消除,但磺酸酯却有更长的达峰(15～19 h)和消除时间,且在给药后36h血浆中仍可测到。K-3-G的血药浓度大大高于K-7-G,Cmax和AUC是K-7-G的3～5倍。K-7-S的Cmax远低于两葡萄糖醛酸苷,但因滞留时间长,其AUC仍远高于原型。以上结果说明山奈酚在体内主要以II相结合物形式暴露,K-3-G是主要的代谢产物。基因敲除小鼠药动学表明当表达在BL面的Mrp1敲除后,与野生型相比,三种代谢产物的Cmax,AUC0-t和MRT均显著降低。而AP面表达的Bcrp和Mrp2敲除后,三种代谢产物的血药浓度上升,Cmax和AUC0-t显著增加。P-gp敲除使K-3-G的Cmax和AUC0-t显著降低,但并不明显影响K-7-G和K-7-S。这些结果表明Mrp1、Mrp2和Bcrp在调控山奈酚体内暴露水平中的重要作用。3.山奈酚的肠道处置及体外代谢当灌流5或20 山奈酚后,苷元的吸收在结肠最高,并显著高于空肠和回肠。两个灌流浓度之间渗透系数无差异。山奈酚可在肠道中发生UGT和SULT代谢。灌流液中检测到大量的K-3-G和K-7-G,在十二指肠、空肠的外排最高在结肠外排最低。相反地,K-7-S在结肠外排最高而在回肠外排最低。此外,十二指肠和空肠外排的K-7-G略多于K-3-G而回肠和结肠外排的K-7-G显著多于K-3-G。在胆汁中,K-3-G外排量在各时间点是K-7-G的3～5倍,血浆中只能检测到K-3-G。这说明山奈酚经肠吸收后体内的主要暴露形式是K-3-G。体外孵育实验表明山奈酚的葡萄糖醛酸化反应速率在小肠段高而在结肠最低。在三个底物浓度下,K-3-G和K-7-G均在空肠有最大的生成速率。肝微粒体催化生成较多的K-7-G。山奈酚在肝脏的磺酸化代谢速率远高于肠,而在四肠段中结肠最高,并显著高于十二指肠和回肠。以上结果说明在肠道中山奈酚的UGT代谢主要发生在小肠段,而SULT代谢主要发生在结肠,这可能影响它们的药时曲线。K-7-S的生成具有滞后效应,很可能是其药时曲线特征不同于葡萄糖醛酸苷的原因。4.外排转运蛋白和UGT-BCRP偶联对山奈酚代谢的调控作用及机制山奈酚在Caco-2细胞上可发生UGT代谢和SULT代谢。无论苷元给药于AP或BL面,在BL面,K-3-G的外排速率显著高于K-7-G,而在AP面,K-7-G的外排速率显著高于K-3-G,说明K-3-G更易被外排至BL面。这一现象与肠灌流数据相结合,说明外排转运蛋白对山奈酚葡萄糖醛酸苷的位置异构体表现出选择性差异。外排转运蛋白决定了山奈酚在体内以大量的K-3-G形式暴露。加在AP面的维拉帕米对葡萄糖醛酸苷的外排速率,胞内浓度和Fmet没有造成任何显著性差异,但是K-7-S的双面外排速率和Fmet(BL to AP)被显著降低,暗示维拉帕米或可影响山奈酚的SULT代谢。加在AP面的Ko143不同程度地降低了 K-3-G和K-7-G的双面外排量,并显著降低两者的外排速率和Fmet,暗示Ko143或可影响山奈酚的UGT代谢。加在AP面的LTC4显著降低了 K-3-G和K-7-G在AP面的外排量,并显著升高了 K-3-G和K-7-G的细胞内浓度(AP to BL),但降低了三种代谢产物的Fmet(BL to AP)。BL面加入MK571,三种代谢产物向BL面的外排被显著降低,而向AP面的外排未受抑制,说明MK571加在BL面并不影响AP面的MRP2。MK571未显著升高代谢产物的细胞内浓度。以上数据说明山奈酚II相代谢产物可能是BCRP,MRP2和BL面的MRPs的底物。在高表达UGT1A9和UGT1A1的HeLa细胞上,山奈酚可被代谢为K-3-G和K-7-G,随后被外排至胞外。两葡萄糖醛酸苷的清除率和Fmet随给药浓度增加而下降,相应地,两葡萄糖醛酸苷的细胞内浓度随给药浓度增加而增加。加入BCRP抑制剂Ko143后,两葡萄糖醛酸苷的外排速率和清除率被浓度依赖性地显著降低。尽管Fmet受到不同程度的影响,两葡萄糖醛酸苷的细胞内浓度显著上升。这些数据说明K-3-G和K-7-G的外排是BCRP介导的,UGT-BCRP偶联是山奈酚重要的药物处置途径之一。四、结论在本实验中,我们采用了体内、体外和在体实验联合的方法研究山奈酚的体内代谢和药动学,并发现各数据有良好的相关性。山奈酚在体内主要以II相代谢产物形式暴露,包括两个葡萄糖醛酸苷和一个磺酸酯,其中K-3-G是最主要的暴露形式。外排转运蛋白(BCRP,MRP1和MRP2)调控着山奈酚II相结合物的体内暴露水平。全面的药动学考察或对山奈酚的体内药效研究提供新的视角和依据。