分子靶向治疗主要针对病变细胞,具有特异性抗肿瘤作用,可以减少对正常组织的损伤,因此毒性(骨髓抑制、脱发和肾功能损害等)明显减少。近十几年,分子靶向药物的研发呈现了迅猛发展的态势,入选了本世纪最初10年科学领域十项重大进展。目前临床上采用的分子靶向药物主要为单克隆抗体药物和小分子药物(主要为蛋白酪氨酸激酶抑制剂)两类。随着核磁共振技术、分子生物学、X射线晶体学的发展,越来越多的生物大分子结构被解析。因此,利用基于靶点结构的药物分子设计方法,根据特定疾病相关的靶标分子的蛋白晶体结构来合理地设计出具有靶向性的小分子药物,这样能大大降低和缩短寻找新药的成本与周期。目前已成各大制药公司和药物研发机构进行创新药物研究的主要手段。蛋白酪氨酸激酶是催化ATP上γ-磷酸化转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶,能催化多种底物蛋白酪氨酸残基磷酸化,参与正常细胞的调节、信号传递和发育,也与肿瘤细胞的增殖、分化、迁移和凋亡密切相关。在人类基因组中已经确定大约518种人类蛋白激酶,其中超过90个为蛋白酪氨酸激酶。研究表明有超过50%的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性,它们的异常表达将导致细胞增殖调节发生紊乱,进而导致肿瘤发生,酪氨酸激酶的异常表达还与肿瘤的侵袭和转移,肿瘤新生血管的生成,肿瘤的化疗抗性密切相关。因此,干扰或阻断蛋白酪氨酸激酶信号通路已成为抗肿瘤药物的研究热点。ROS1是一种原癌基因,属于孤儿受体酪氨酸激酶,具有独特的致癌序列,在多种肿瘤细胞系中高表达。ROS1和ALK在氨基酸激酶结构域范围内有49%的同源性,并且在ATP结合位点存在77%的同一性。ROS1基因的融合、过表达和突变均会导致ROS1蛋白的失调,其中ROS1融合基因的产生是最常见的异常形式。异常的ROS1蛋白激酶活性将激活下游多条致癌信号途径,从而诱导肿瘤细胞生长,增殖和转化。到目前为止,ROS1融合基因已经在多种恶性肿瘤中被发现,其中包括恶性胶质瘤,胆管细胞癌、卵巢癌、胃癌和非小细胞肺癌,但其更倾向于在年轻、从未吸烟或轻度吸烟的不同分级的肺腺癌患者。2007年,研究者证实了ROS1基因重排是在非小细胞肺癌发生,发展的驱动基因。ROS1作为确认较晚的抗肿瘤药物新靶点,其天然配体尚不清楚。目前国内外关于ROS1抑制剂的研究较少,目前具有ROS1抑制活性的化合物,绝大数具有其他激酶抑制活性,早期并非作为ROS1抑制剂进行研究。Crizotinib是目前唯一处于Ⅲ期临床试验的ROS1抑制剂,但它同时也能抑制C-Met和ALK。通过前面部分的介绍,我们了解到ROS1是种致癌驱动基因,具有ROS1活性的小分子抑制剂比较少,特别是选择性ROS1抑制剂的研究。由于小分子的多样性,我们利用现有的研究基础结合最新的分子生物学研究背景和计算机辅助药物设计知识,开发出高活性、结构更加新颖的选择性ROS1小分子抑制剂显得尤为迫切。本论文以ROS1受体酪氨酸激酶,结合ALK激酶“DFG-shifted”构象的蛋白晶体结构为研究基础,以寻找酶水平或细胞水平靶向性强、抗肿瘤活性高的小分子化合物为目标,综合应用基于靶点结构的药物设计、化学合成、生物活性评价和分子模拟等方法手段,针对Crizotinib和化合物A进行了系列化合物的设计、合成和生物活性评价、初步构效关系以及分子模拟研究。主要研究工作和结果:1.根据Crizotinib与ROS1复合物的晶体结构和结合能够识别ALK激酶“DFG-shifted”构象的化合物A。通过分子骨架跃迁,希望设计能靶向ROS1激酶的小分子抑制剂。首先,保留Crizotinib苄氧氨基吡啶作为ROS1“铰链”区域结合的核心基团。其次,考虑将吡啶环上氨基的氢原子用不同的芳杂环或苯芳环取代以稳定氨基吡啶与“铰链”区域结合构象。第三,增加“linker”酰胺基,并连接带有取代基的苄基,完成苄氧氨基吡啶类化合物分子的骨架构建。通过生物电子等排体原理,将化合物A的母核嘧啶环替换成吡啶环,3,4,5-三甲氧基苯基用芳杂环或苯芳环取代,苄基上由不同位置,不同性质的基团进行取代。设计出了氨基吡啶哌啶甲酰胺类化合物。2.以商业可提供的化合物为原料,设计出了各类化合物的合成路线。经溴化,酯化,还原,Mitsunobu反应,水解,缩合,Buchwald-Hartwig偶联,亲核取代等反应合成出了3-苄氧氨基吡啶类化合物,4-苄氧氨基吡啶类化合物,氨基吡啶哌啶甲酰胺类化合物三个系列共45个新化合物(8a-8n,13a-13r,14a-14c,19a-19i,24)以及30个关键中间体。所有目标化合物均经过核磁共振和质谱进行了结构确证。对所有目标化合物的合成均涉及到的Buchwald-Hartwig偶联的条件做了优化,以DMF作溶剂,pd2(dpa)3作催化剂,BINAP为配体,碳酸铯作碱,缩短了反应时间,获得了较高的收率。3.对上述合成的新化合物进行了激酶活性测试,有9个化合物在1 浓度下对ROS1的抑制率大于40%,化合物13b-13d和14a-14c对ROS1 IC50值的范围为365-639 nM,其中以化合物14c的ROS1活性最优。4.我们选择化合物14c和19g进行了激酶选择性测试。结果表明,化合物14c对ROS1具有良好的选择性,对所选的12种激酶在1 浓度下的抑制率都小于20%,相对于ALK其对ROS1的选择性达到了 12倍。而化合物19g除了展现了较好的ALK和ROS1活性外,还表现出了较好的LTK活性。5.细胞抗增殖实验结果表明,ROS1激酶活性在纳摩尔级别的化合物对H3122和HCC-78两个细胞株的抗增殖活性都在微摩尔范围。其中一些化合物的激酶抑制活性与细胞抗增殖活性没有呈现一定的相关性,特别是化合物13b-13c和14b-14c对高表达融合基因SLC34A2-ROS1的细胞株HCC-78不敏感(IC50>50μM),而化合物13d和14a对HCC-78展现出了较好的抗增殖活性(IC50值分别为8.1和9.0μM)。化合物19g对H3122的抗增殖活性比HCC-78稍好,与激酶活性的测试结果具有较好的相关性。6.我们对新合成化合物的ROS1活性的初步构效关系进行了总结:一、4-苄氧氨基吡啶类化合物比3-苄氧氨基吡啶类化合物的ROS1活性好。二、4-苄氧氨基吡啶类化合物中的氨基取代以亲水性基团对活性有利,其中4-吡唑哌啶为最优基团,然后依次为1-甲基-4-吡唑哌啶,嘧啶,1,3-二甲基吡唑,1-甲基吡唑,而其他杂环或苯环的活性较差。三、4-苄氧氨基吡啶类化合物中卞基基团的取代以给电子基团对活性的贡献大,其中3,4,5-三甲氧基为最优基团,其次为3,4-二甲氧基和4-甲基,吸电子基团4-氰基也表现出了较好的ROS1活性。其余双取代强吸电子基团的活性差。四、氨基吡啶哌啶甲酰胺类化合物以S构型的活性好。7.我们选择对ROS1活性最优的化合物14c,以Crizotinib作为参比对照进行了分子模拟研究。分子模拟研究了化合物14c的分子对接以及化合物14c和Crizotinib与ROS1复合物体系的RMSD与轨迹、RMSF、氢键分析、结合自由能以及自由能分解。从分子模拟的研究结果我们得出了:范德华相互作用是对化合物14c和Crizotinib与ROS1复合物体系结合自由能的贡献是最有利的。化合物14c与ROS1铰链区关键残基Met2029的结合能力比Crizotinib弱,而化合物14c在P-loop区作用比Crizotinib强,另外化合物14c与DFG序列的Asp2102形成额外的氢键。以上实验结果从理论上解释了化合物14c的ROS1活性比Crizotinib差,而选择性比Crizotinib好的原因。综上所述,基于Crizotinib与ROS1复合物的晶体结构结合能够识别ALK激酶“DFG-shifted”构象的化合物A,设计合成了45个新化合物,均未见相关文献报道,此外还合成了30个关键中间体。对所有目标化合物的合成均涉及到的Buchwald-Hartwig偶联的条件做了优化,缩短了反应时间,获得了较高的收率。设计合成的系列化合物以4-苄氧氨基吡啶类具有较好的ROS1活性,特别是化合物14c对ROS1的IC50值达到了365 nM,但其对高表达融合基因SLC34A2-ROS1的细胞株HCC-78不敏感。激酶选择性测试表明,化合物14c对ROS1具有良好的选择性。分子模拟研究从理论上解释了化合物14c的ROS1活性比Crizotinib差,而选择性比Crizotinib好的原因。4-苄氧氨基吡啶类化合物具有ROS1抑制活性尚未见文献报道,是一类全新结构的选择性ROS1抑制剂,突破了目前已有的几种ROS1结构类型的限制,且这类化合物结构具有极大的可塑性,可作为开发新型ROS1抑制剂的先导化合物。通过进一步研究极有可能发现活性更好,选择性更高的新型ROS1小分子抑制剂,可为开发具有临床应用价值的ROS1酪氨酸激酶抑制剂奠定基础。