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泛素/26S蛋白酶体系统(ubiquitination/26s proteasome system,UPS)参与调控几乎所有的植物发育和信号传导过程。在真核生物中有一种位于ER上的特殊的UPS体系称之为内质网相关的蛋白降解(endoplasmic reticulum-associated degradation,ERAD)。ERAD特异性地降解滞留在内质网(endoplasmic reticulum,ER)中的错误折叠蛋白以及未组装的蛋白亚基。ERAD组分及途径在酵母和哺乳动物中已经有比较详细的研究,但植物ERAD的组分及生物学功能还未见报道。本研究主要关注的是HRD3基因,酵母中HRD3编码参与ERAD机制的HRD1复合体中的一个重要组分,其在拟南芥中具有两个同源基因。实验证明其中一个HRD3B是假基因,而HRD3A虽非必需基因但其编码的蛋白对植物ERAD功能而言不可或缺。通过利用细胞生物学和分子遗传学的方法对ERAD重要组分HRD3A的分析,我们发现ERAD在植物耐盐胁迫过程中发挥重要作用。同时研究还发现ERAD参与了植物对ABA信号的响应过程。盐处理时植物细胞中泛素化蛋白的总量增加,特别是细胞中高甘露糖化的蛋白增加预示着非正确折叠蛋白的增加。大量错误折叠蛋白快速地在ER中积累并诱导非正确折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。HRD3A的缺乏使UPR发生改变、增加了植物对盐胁迫及植物激素ABA的敏感性并且使ERAD的底物蛋白在细胞中积累。我们更进一步证明Ca2+离子从ER中的释放参与诱导UPR的过程,且ERAD功能缺失影响盐胁迫下活性氧(reactive oxygen species,ROS)的积累。
在植物ERAD机制的研究过程中,我们发现对于整个UPS体系而言,由于技术方面的限制,迄今为止仅有少量E3连接酶与特异性底物间的生化机制见于报道。为了推进该领域的研究我们建立了通过农杆菌注射的方法在烟草体内检测蛋白泛素化的高效系统。用已知的E3泛素连接酶-COP1与其底物-HY5作为例子,我们证明了所建立的烟草系统可以很方便地检测E3和底物的相互作用,底物自身的泛素化以及蛋白酶体抑制剂MG132对底物降解的抑制作用。通过用底物自身所带的分子标签抗体或泛素蛋白抗体做western分析,我们可以区分底物蛋白自身形式及其泛素化形式。用烟草瞬时表达得到的E3连接酶和底物蛋白还可以用来检测体内或体外的泛素化反应。同时我们还优化了蛋白质在烟草中的表达条件:在注射的同时加入基因沉默抑制子p19可以明显提高蛋白的表达量；而注射后不同天数取样也发现不同蛋白其表达的最佳点有很大的差别；最后我们还探索了不同实验目的所需的蛋白提取液类型。我们相信该系统也可以用于其它蛋白修饰领域的研究。