人类神经生长抑制因子(humanneuronalgrowthinhibitoryfactor,hGIF)属于金属硫蛋白家族，又称金属硫蛋白．3(metallothionein-3，MT3)。它由68个氨基酸组成，包含20个保守的半胱氨酸。和其它金属硫蛋白成员一样，hGIF能结合7份二价d10金属离子诸如Zn2+、Cd2+，形成两个相对独立的结构域，每个结构域分别包裹着一个金属硫簇，结构域之问由一段3个氨基酸组成的linker联接，整个分子呈哑铃形状。hGIF主要在中枢神经系统表达，有研究显示大脑皮层拥有大量富含游离锌的神经元，hGIF的分布同这些神经元的分布基本一致，暗示hGIF可能参与游离Zn2+的细胞内传递与调控。老年痴呆症是一种神经退行性疾病，病人脑提取液中hGIF的表达水平明显低于正常人，这导致神经元不受约束的生长，过度消耗了营养，最终使神经元调亡；此外，对动物模型的研究显示，当大脑受到损伤后hGIF的表达量出现明显变化。这些研究说明hGIF可能与神经元的生长调控和修复有关。尽管关于hGIF抑制神经元生长的机理以及它的靶分子尚且不清楚，种种迹象表明多种因素共同参与调节其生理活性。 本实验室已有多年研究金属硫蛋白的历史，曾经在大肠杆菌中构建了金属硫蛋白的高效表达体系，并且优化了纯化步骤，获得很高的蛋白产量；通过基因工程技术，本实验室还曾经构建了一系列hGIF的突变体，并且详细研究了结构与蛋白稳定性、反应性之间的关系。在此基础上，为进一步阐明hGIF结构、性质和功能之间的关系，我们全面而系统的考察了hGIF一系列位点上的突变对神经元生长抑制活性的影响。这些突变体包括：1)针对肽链N端p结构域(1．30)保守的Thr5设计的突变体(AT5、T5A、T5S)；2)针对肽链N端D结构域保守的CPCP序列的突变(P7S／P9A)3)围绕保守的Glu4位点的突变(E4W、AE4、P3S／E4R)；4)NO反应的酸碱催化位点的突变(E23K)；5)围绕肽链C端α结构域(34-68)的EAAEAE插入段设计的突变体(A55-60、E58K、E55／58／60Q、G53／54A)；6)对linker进行改造(△31．34、A32-33、KKS-SP)；7)结构域间的转换杂合(A34-36、βMT3-βMT3、pMT3-aMTl)；8)单结构域(β-domain、α-domain)等。 活性测试研究表明，1)β结构域对hGIF的神经元抑制活性是必须的，其中hGIF独有的保守T(5)CPCP(9)序列尤其重要。2)我们还发现，Thr5侧链上的羟基基团同生理活性密切相关，人为地除去羟基将导致突变体生物活性严重丧失。参考突变体蛋白结构和反应性的结果，我们认为一方面Thr5的羟基可能通过形成分子内氢键帮助稳定hGIF的结构，另一方面Thr5也是一个潜在地磷酸化位点。3)再次，虽然保留了TCPCP序列，但是E23K突变体完全失去了神经元生长抑制功能。以往的研究指出，E23K除了金属硫簇的暴露程度提高，其光谱学性质和反应性均和野生型hGIF相似。尽管E23K丧失生理活性的原因有待进一步研究，我们的结果说明除了TCPCP序列，p结构域中的其它残基也可以影响hGIF执行其功能。4)我们还发现，在旺结构域中，改变E(55)AAEAE(60)插入段的电荷分布，或者增加它形成α螺旋的倾向，并不太多地影响整个突变体蛋白的生物活性。然而，EAAEAE插入段缺失干扰了蛋白的正常活性。对α结构域的结构解析表明，EAAEAE插入段在hGIF蛋白中是一段非常松散、不受约束的无规卷曲，它使得α结构域的动力学性质更加活泼。进一步，α结构域也通过结构域间的相互作用，影响到β结构域，问接的改变了p结构域的动力学性质和其它相关性质，从而干扰了hGIF蛋白的生理活性。5)最后，在hGIF中linker的部分或完全缺失对活性没有太大的影响，可是，当用sP(甲壳纲动物MT的linker)取代KKS(哺乳动物MT的linker)作为linker时，突变体KKS-SP的生物活性就基本丧失了。从进化的角度看，这也是自然界为什么选用保守的KKS作为linker的一个原因。 有研究指出，在酵母双杂交实验中hGIF能与Rab3A蛋白相互作用，并且hGIF和GDP／Rab3A的结合具有特异性(Ko=2．6gM)。Rab3A属于Ras家族，能够结合GTP，并具有GTP水解酶活性。当Rab3A与GTP结合时，GTP／Rab3A形成具有活性的蛋白构象，通过和下游蛋白相互作用引发一系列过程，调节神经元突触囊泡的运输；当Rab3A将结合的GTP水解成GDP后，GDP／Rab3A结构的构象发生变化，蛋白失去活性。同时，Rab3A和GDP或GTP的这种结合也受到多种蛋白的调控，包括GEPs(guaninenucleotideexchangeproteins)、GAPs(GTPase-activatingproteins)和GDIs(GDPdissociationinhibitors)等。目前为止，对Rab3A和hGIF之间关系的了解还非常少。为了探索它们之间的相互作用，我们运用分子克隆构建了GST-Rab3A融合蛋白表达系统质粒，蛋白在大肠杆菌中表达，纯化后蛋白分子量经MS验证正确无误。随后，我们对hGIF和Rab3A的相互作用进行了初步的研究。 GIF(即MT3)和金属硫蛋白I和IV(MTl，MT4)都属于金属硫蛋白家族，它们的一级序列具有很高的同源性，可是，只有GIF表现出神经生长抑制活性。GIF的这种生理活性是否同它金属硫簇的结构、性质有关呢?为此，我们考察了hGIF金属硫簇的结构、性质，并同人类MTlg(hMTlg)、小鼠MT4(mMT4)进行了比较。结果表明，hMTlg和mMT4的金属硫簇具有相似的结构和稳定性，而相比之下，hGIF金属硫簇结构有所差异，且稳定性降低；其次，hGIF和hMTlg、mMT4之间金属硫簇结构和稳定性的差异，导致其和巯基试剂的反应性也受到影响；最后，不同蛋白传递金属离子至EDTA的能力依次为hGIF>hMTlg>mMT4。总体来看，hGIF在溶液中结构比hMTlg和mMT4更加松散。我们认为，hGIF的这种性质是几个因素共同作用的结果：hGIF相对较多的负电荷，EAAEAE插入段，CPCP保守序列，以及结构域之间的相互作用等，都可能对hGIF的金属硫簇结构和性质产生影响，并进一步影响其功能。 总之，通过构建突变体蛋白、神经元培养和活性考察、结构性质研究等一系列手段，我们研究了可能影响hGIF神经元生长抑制活性的各结构基元和特定的氨基酸残基，认为hGIF的生理活性受到多种因素调控，包括Trh5羟基基团、CPCP保守序列、结构域间的相互作用、linker影响、金属硫簇的结构性质等等。