背景和目的：瘦素是脂肪组织分泌的激素,由肥胖基因(obese gene, ob)编码,具有抑制食欲、调节能量代谢、神经内分泌、生长、生殖和免疫反应等多种功能。瘦素通过结合瘦素受体发挥其广泛的生理作用。通过与下丘脑的受体结合降低食欲和增加能量消耗；通过与外周组织受体结合影响一系列机体代谢过程,如胰岛素的释放、脂肪的分解合成、葡萄糖的产生、转运、代谢及胰岛素抵抗等。在人体,先天性瘦素基因缺陷将罹患极度肥胖,给予瘦素治疗后可以显著地降低体重。此外,瘦素与多种疾病,如糖尿病、肾病、心血管疾病、非酒精性脂肪性肝病、肿瘤等的发生密切相关。同其他激素一样,瘦素的生物学活性受到精细的调节,如瘦素的水平、瘦素受体的表达、瘦素在体内的稳定性及清除率等。现知道,瘦素在血液循环中以游离型和结合型两种形式存在,其游离型具有生物活性。血液中的瘦素结合蛋白通过结合瘦素调节其游离型／结合型的比值(即游离瘦素指数free leptin index, FLI),在瘦素的稳定性、清除率及生物学活性的调节中发挥重要作用。而血液中可溶性瘦素受体(soluble leptin recetor, sOB-R)的确切组织来源及其调控因素目前尚未完全清楚。在大鼠及小鼠等实验动物模型的研究结果显示,肝脏瘦素受体的基因表达在调节血浆可溶性瘦素受体水平中具有至关重要的作用。采用1251标记的瘦素静脉注射大鼠,观察活体内瘦素结合活性的相对组织分布,结果显示：80%的放射性瘦素结合在肝组织中,表明肝脏是机体结合瘦素的主要器官。特异敲除肝细胞瘦素受体的小鼠(OB-RAlbKO),其血浆中sOB-R的诱导表达作用儿乎消失。对118名健康人血液检测分析发现,血浆中sOB-R及游离瘦素指数(FLI)还受到体脂量、性别、性激素等因素的调节,其中sOB-R与糖皮质激素水平呈显著的正相关(r=0.27,P<0.01)。鉴于肝脏是糖皮质激素作用的重要靶器官,也是瘦素受体表达最丰富的器官。我们推测糖皮质激素可能直接通过作用于肝细胞上的相应受体,诱导瘦素受体基因表达,为血浆sOB-R提供了最主要的来源。为此,我们在培养的正常肝细胞(L02)及肝癌细胞(HepG2)中直接地检测了地塞米松(人工合成的糖皮质类激素)对瘦素受体基因表达的影响。同时,通过对相关文献的分析,我们发现胰岛素信号在调节肝细胞瘦素受体基因表达中发挥着至关重要的作用。小鼠肝脏特异敲除胰岛素受体(liver-specific ins μlin receptor knock-out, LIRKO)后,其血液中瘦素的含量与野生型小鼠相比升高10倍,可溶性瘦素受体的含量升高80倍。采用实时定量PCR检测,发现LIRKO小鼠肝脏中Ob-Ra、Ob-Rb及Ob-Re的mRNA含量均显著升高,但这一现象并未在脂肪或肌肉组织胰岛素受体敲除的小鼠体内出现。这为我们深入探讨OB-R基因表达调控的分子机制提供了重要的线索。FOXO1是受胰岛素信号负性调节的重要转录因子,同时又是受糖皮质激素诱导的转录因子。因此,我们进一步采用脂质体介导的基因转染技术结合siRNA干扰等方法,观察了肝细胞中FOXO1表达水平的改变对Ob-R基因表达的影响,并利用报告基因分析技术在Ob-R基因启动子水平进行了初步的验证。研究旨在从分子水平上加深对瘦素活性的内分泌调节机制的认识,并为瘦素功能失调相关疾病的内分泌干预等将提供有价值的基础研究依据。材料方法：1.在培养的正常人肝细胞(L02)和肝癌细胞(HepG2)上,采用不同浓度的地塞米松(DEX)处理细胞,提取细胞总RNA和总蛋白质,通过逆转录-PCR、Real-time PCR、 Western Blot等观察DEX对瘦素受体基因表达的影响。2.采用脂质体介导的基因转染技术,在HepG2上导入siRNA特异干扰细胞内源性转录因子FOXO1的表达,或导入组成性活性的FOXO1表达质粒(FOXO1-TSS),观察转录因子FOXO1对瘦素受体基因表达的影响。3.采用启动子报告基因分析系统,将已克隆的人瘦素受体启动子(-3296～+105bp)与荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic连接而构建的报告基因载体,通过脂质体介导的基因瞬时转染技术导入HepG2细胞,检测细胞内荧光素酶活性,并以转染的β-半乳糖苷酶活性为对照,观察了siRNA干扰转录因子FOXO1对瘦素受体(OB-R)的启动子活性的影响。结果：1.地塞米松(糖皮质激素)能诱导肝细胞中总瘦素受体(OB-Rt)及长型瘦素受体(OB-Rb)的mRNA表达。2.地塞米松对瘦素受体的诱导作用具有一定的“剂量范围”,在肝癌细胞中50-500nM均能起诱导作用,且诱导效应显著(可高达30倍)；而在正常肝细胞中DEX的诱导剂量范围较窄(50-100nM),且诱导效应温和(仅3-4倍)。3.地塞米松(糖皮质激素合成物)能诱导肝细胞中转录因子FOXO1的基因表达。4FOXO1可以直接调节瘦素受体的启动子活性,FOXO1降低抑制了瘦素受体的启动子活性,反之FOXO1表达升高则增强了瘦素受体的启动子转录活性。5.肝细胞中瘦素受体(OB-Rb)的表达受FOXO1的调节,FOXO1条低抑制了瘦素受体的mRNA表达,反之FOXO1表达升高则增强了瘦素受体的基因表达。结论：1.地塞米松(糖皮质激素)能诱导肝细胞中总瘦素受体(OB-Rt)及长型瘦素受体(OB-Rb)的mRNA表达。2.地塞米松(糖皮质激素合成物)能诱导肝细胞中转录因子FOXO1的基因表达。3.肝细胞中瘦素受体的表达受FOXO1的调节,FOXO1表达水平降低抑制了瘦素受体的mRNA表达,反之FOXO1表达升高则增强了瘦素受体的基因表达。综上所述,本研究首次发现转录因子FOXO1参与了瘦素受体基因表达的调节。但FOXO1如何诱导瘦素受体的详细分子机制仍待阐明,FOXO1是通过与瘦素受体启动子上的结合位点直接促进其表达,还是通过诱导其他转录因子间接刺激其表达尚需更多的实验加以证实；此外,糖皮质激素是否通过诱导FOXO1参与瘦素受体的基因表达仍有待进一步实验验证。