基于磁性微粒的莱克多巴胺检测和DNA纯化方法的建立

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磁性微粒是超顺磁性纳米粒子与有机或无机材料通过包覆、交联等方式而形成的纳微米级复合粒子。磁性微粒具有超顺磁性、较高的比表面积、可修饰功能基团等特性。因此,将抗原/抗体、酶、核酸/寡核苷酸、小分子药物等固定在其表面,可用于免疫学检测、核酸纯化、细胞分选、药物载体和酶的固定化等生物医学研究领域。分别以两种不同的磁性微粒(金磁微粒和羧基末端硅烷化磁性微粒)为载体,本研究建立了苯酚型β-兴奋剂莱克多巴胺的检测方法和从生物样品中方便、快速纯化DNA的方法。具有组装结构的金磁微粒(Fe3O4/Au)是结合磁性氧化物粒子和胶体金特点的复合微粒,兼有在外磁场中可分离及生物分子快速固定化等特点。将莱克多巴胺与卵清蛋白的偶联物(RCT-OVA)固定在金磁微粒表面,利用间接竞争酶联免疫吸附检测(IC-ELISA)的原理建立了莱克多巴胺定量分析方法并用于动物尿液、饲料和组织中的莱克多巴胺含量的测定。对抗原在金磁微粒表面的固定化浓度、单克隆抗体稀释度等条件进行优化,绘制了莱克多巴胺测定的标准曲线并确定了方法的检测限、回收率等参数,同时对莱克多巴胺与其它β-兴奋剂的交叉反应率也进行了测定。结果表明:在1~100 ppb的浓度范围内方法的线性关系良好,相关系数为0.993,最低检测限为0.668 ppb;回收率在72.6~106.2%之间,变异系数不超过13.4%。其它β-兴奋剂与RCT抗体交叉反应率均很低。整个反应(包括样品制备)可在4 h内完成。与市售酶标板为载体的检测试剂盒相比较,金磁微粒作为固相载体可提高检测的灵敏度,同时线性关系、最低检测限、回收率和变异系数等参数符合免疫学检测要求,本方法可用于尿液、饲料和组织中莱克多巴胺含量的测定。本论文以表面含有羧基的硅烷化磁性微粒为载体,系统开展了从全血和唾液中纯化基因组DNA,从大肠杆菌中纯化质粒DNA的方法研究。对裂解液的组成、磁性微粒的种类及用量、固定体系中固定缓冲液的体积比等参数进行了优化,建立了小规模较为稳定的从全血中纯化基因组DNA、从细菌中纯化质粒DNA的方法,并对DNA得率、重复性、批间差等进行了测定。本论文初步建立了从唾液中纯化DNA的方法。结果表明:0.1 mg羧基磁性微粒可用于纯化200μL全血的基因组DNA,得率在3~7μg之间,OD260/OD280在1.7~1.9之间,CV值小于8%。DNA产率高于国内试剂盒的指标,可与国外产品媲美;初步建立了0.1 mg羧基磁性微粒纯化200μL唾液中的基因组DNA的方法,得率在0.5~4μg之间;0.2 mg羧基磁性微粒可用于纯化1 mL大肠杆菌液中的质粒DNA,得率在4~12μg之间,OD260/OD280在1.7~1.9之间,不同批次纯化质粒DNA得率的CV值小于12%。与传统DNA纯化方法相比,该法具有操作时间短、方便、无有机试剂污染等优点。
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