牛支原体是导致牛的多种疾病综合症的病原体之一,并给养牛业带来了严重的经济损失。但是,由于缺乏有效的基因操作工具,关于牛支原体的致病机理的研究相对较少。作为功能性的DNA复制起始元件,oriC基因序列已经在多种支原体中得到应用,但是尚无在牛支原体中应用的报道。本研究利用牛支原体的oriC序列构建了可以转染牛支原体的载体系统。通过截短试验,找到牛支原体oriC最小的功能域,该区域富含A+T,并且包含两个dnaAbox。通过稳定性实验检测,本研究构建的oriC载体转化株经过30次传代,载体仍然能够以质粒的形式稳定存在,而没有整合到牛支原体的基因组中。即使在无抗性筛选的条件下,转化株经30次传代仍然能够携带质粒。另外,该载体系统能够在牛支原体中成功表达由LacZ报告基因编码的外源蛋白p-半乳糖苷酶,以及同FLAG标签蛋白融合表达的内源蛋白。同时,利用Western blot验证了该oriC自我复制载体具有作为过表达载体使用的潜能。牛支原体没有细胞壁,因此细胞膜对于其生长、繁殖以及黏附宿主细胞起着至关重要的作用。为了探究牛支原体膜蛋白以及膜相关蛋白的基因功能,利用该载体系统,分别构建了MBOVPG45₀790蛋白和P48蛋白过表达牛支原体菌株,通过间接免疫荧光方法与流式细胞术分别比较了牛支原体PG45标准株、MBOVPG45₀790蛋白过表达株和P48蛋白过表达株对牛肾细胞的黏附与诱导凋亡的作用。MBOVPG45₀790蛋白过表达株和P48蛋白过表达株对牛肾细胞的黏附以及诱导凋亡的程度与对照组无明显差异,显示了这两种蛋白的单一过表达不会对牛支原体黏附及诱导牛肾细胞凋亡产生影响。综上,本研究利用复制起始元件oriC、启动子元件prvVSPA以及抗性基因元件tetM成功的构建了应用于牛支原体的自我复制载体系统,并且优化了该系统的大小及转化条件。利用该系统在牛支原体中成功的表达了外源及内源蛋白。同时,检测了两种细胞膜相关蛋白对牛肾细胞的黏附及诱导凋亡的影响。随着牛支原体基因组序列拼接的完成,构建的自我复制载体系统为研究牛支原体相关基因的功能及致病机理提供了良好的平台。