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研究背景:甲基苯丙胺Methamphetamine(METH),是一种广泛滥用的非法精神药物。我们以前的研究表明,CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)是一个重要的调节因子,参与了 METH诱导的神经元自噬和凋亡。然而,这一过程的具体分子机制仍不清楚。以往的研究表明,DDIT4、Trib3、α-syn参与了 METH诱导的神经毒性。于是我们猜测C/EBPββ参与了 METH诱导的DDIT4介导的自噬和Trib3介导的凋亡。方法:第一章第一节建立时间梯度和浓度梯度的METH中毒体外模型,通过Western Blot观察随着METH给药时间和浓度增加,TSC2、pTSC2等蛋白的表达量情况。第一章第二节构建DDIT4特异性小干扰RNA,下调DDIT4表达后,Western Blot检测pTSC2和mTOR自噬通路相关蛋白的表达。第一章第三节构建抑制C/EBPβ表达的特异性小干扰RNA,Western Blot检测经Si-C/EBPβ处理后,DDIT4、pTSC2及mTOR自噬通路相关蛋白的表达。第二章第一节构建抑制α-syn表达的小干扰,Western Blot检测经Si-α-syn处理后,METH诱导的线粒体凋亡信号通路是否受到抑制。第二章第二节建立时间和浓度梯度的METH中毒体外模型,Western Blot观察Parkin的表达量变化情况。构建Parkin过表达的细胞系,检测过表达Parkin后,α-syn、Bax/Bcl-2及自噬通路相关蛋白的表达。第二章第三节构建小干扰Si-Trib3,检测Trib3抑制后,Parkin、α-syn、Bax/Bcl-2及自噬通路相关蛋白的表达。构建小干扰Si-C/EBPββ,检测C/EBPβ抑制后,Trib3、Parkin、α-syn、Bax/Bcl-2及凋亡通路相关蛋白的表达,同时通过免疫荧光检测干扰C/EBPββ后,METH诱导的α-syn上调是否发生变化。第二章第四节,在SN区立体定位注射干扰C/EBPββ的重组慢病毒,动物模型上检测C/EBPβ抑制后,DDIT4、p-TSC2、mTOR及自噬相关蛋白的表达变化情况和Trib3、Parkin、α-syn、Bax/Bcl-2及凋亡相关蛋白的表达.。结果:第一章1.p-TSC2的表达随着METH给予的时间和浓度的增加而增高。2.干扰DDIT4可以抑制METH诱导的p-TSC2增多及mTOR自噬途径。3.干扰C/EBPβ可以抑制METH诱导的DDIT4和p-TSC2增加,同时抑制mTOR自噬信号通路。第二章1.抑制α-syn能逆转METH导致SH-SY5Y细胞的线粒体凋亡信号通路。2.体外模型中证实在METH处理后Parkin表达升高,过表达Parkin可以抑制METH诱导的α-syn增加。3.干扰Trib3以及C/EBPβ可以抑制METH诱导的Parkin降低、α-syn增加及其引起的凋亡。4.体内模型中验证C/EBPβ通过Trib3/Parin/α-syn和DDIT4/TSC2/mTOR途径参与METH凋亡和自噬。结论:基于上述实验结果,我们提出了一种新的METH诱导细胞毒性机制:METH暴露可以增加C/EBPβp蛋白表达,触发DDIT4/TSC2/mTOR信号通路,同时诱发Trib3/Parkin/α-syn相关线粒体凋亡信号通路。