肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是多种慢性肝病向肝硬化进展的必经阶段,是肝脏对各种慢性损伤产生的一种修复反应,持续发展则导致不可逆转的肝硬化,甚至肝癌。因此,肝纤维化是临床干预的主要目标,但迄今尚无理想的治疗手段。国内外共识,合成与分泌细胞外间质(extracellular matrix, ECM)的主要细胞——肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)在肝纤维化发生发展中发挥着核心作用。在此过程中,HSCs经历活化、增殖、大量合成ECM等阶段,并分泌各种细胞因子,以自分泌与旁分泌的形式作用于自身及周围细胞,从而促进以Ⅰ型胶原为主的ECM成分大量生成、沉积。HSCs增殖又是活化的重要表现之一,其数量增多也是引起ECM增多的最主要原因,因此,HSCs活化、增殖在肝纤维化发生发展过程中发挥了至关重要的作用。同时,活化的HSCs凋亡受抑,HSCs细胞数量只增不减,最终导致肝纤维化形成。全面了解肝纤维化的发生机制,能够为肝纤维化的综合治疗提供坚实的理论基础。其中,探索调控HSCs活化、增殖与凋亡的信号转导机制,对于寻求新的治疗方案具有重要意义。第10号染色体缺失性磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten, PTEN)是迄今发现的第一个具有双重磷酸酶活性的肿瘤抑制基因,可负性调控肿瘤细胞的细胞周期、抑制其增殖并诱导其凋亡,其缺失或表达异常与多种肿瘤的发生发展密切相关。近年来,陆续发现PTEN也参与多种纤维化疾病的发生发展。我们在前期研究中发现,在胆总管结扎大鼠肝纤维化形成过程中,HSCs大量活化、增殖,而纤维化肝组织中PTEN蛋白及mRNA表达逐渐下调,PTEN的动态表达与在体HSCs活化、增殖呈显著负相关,而与在体活化HSCs凋亡指数呈显著正相关,提示纤维化肝组织中PTEN的表达下调可能通过引起HSCs活化增殖加快及凋亡阻滞参与肝纤维化的病理过程。进一步在体外实验中,我们成功将以腺病毒为载体的野生型PTEN基因、其突变体G129E基因转染入体外培养的大鼠肝星状细胞系HSC-T6,发现过表达的野生型PTEN及G129E显著抑制体外活化HSCs的增殖、诱导其凋亡,负性调控HSCs细胞周期进程。但迄今为止,PTEN基因对原代HSCs及人HSCs细胞系增殖、凋亡、胶原代谢的影响以及阻断PTEN表达在此过程中可能发挥的作用尚不清楚,PTEN能否作为基因治疗的靶点而在肝纤维化的防治中发挥一席之地尚未可知。因此,本实验在前期实验的基础上,构建了靶向PTEN的RNA干扰重组腺病毒,并分离了大鼠原代HSCs,观察增强与阻断PTEN表达对大鼠原代HSCs及人HSCs细胞系LX2增殖、凋亡、细胞周期调控以及胶原代谢的影响及其信号转导机制,从正反两方面证实PTEN基因对HSCs生物学行为的调控作用。在证实上述腺病毒在体外实验中对HSCs具有显著作用效果的基础上,我们进一步在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中,采用尾静脉注射法,将重组腺病毒导入大鼠体内,观察PTEN基因是否在体内具有潜在的抗肝纤维化作用,旨在为深入揭示肝纤维化的病理生理机制,寻求有效预防和治疗肝纤维的新策略提供理论依据和实验基础。实验内容主要包括以下四部分:第一部分增强与阻断PTEN表达对肝星状细胞增殖、凋亡及细胞周期的调控作用目的:探讨过表达的野生型PTEN、其突变体G129E(丧失了脂质磷酸酶活性仅保留蛋白磷酸酶活性)、靶向PTEN的RNA干扰重组腺病毒PTEN shRNA对大鼠原代HSCs及人肝星状细胞系HSCs LX2增殖、凋亡与细胞周期的影响。方法:采用原位循环灌流和密度梯度离心技术分离大鼠原代HSCs,荧光显微镜观察刚分离的原代HSCs,应用单克隆抗体α-SMA行免疫细胞化学染色鉴定活化的原代HSCs;利用AD293T细胞扩增实验所需的腺病毒(Ad-GFP、Ad-PTEN、Ad-G129E、PTEN shRNA),并测定滴度;将上述重组腺病毒瞬时转染体外培养的大鼠原代HSCs及人LX2,Western blot及real-time Q-PCR技术检测HSCs中PTEN表达变化;MTT及BrdU法检测HSCs增殖;流式细胞术分析细胞周期变化;Western Blot技术检测CyclinD1、CDK4及P27kip1的表达。实验分组如下:①Control组,仅以含8%胎牛血清的DMEM细胞培养液培养细胞,在转染步骤加入无血清无抗生素DMEM代替病毒液;②Ad-GFP组,转染表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的空病毒Ad-GFP;③Ad-PTEN组,转染携带野生型PTEN基因并表达GFP的重组腺病毒Ad-PTEN;④Ad-G129E组,转染携带PTEN的突变体G129E基因并表达GFP的重组腺病毒Ad-G129E;⑤PTEN shRNA组,转染携带靶向PTEN的短发卡状干扰RNA的重组腺病毒。结果:①采用肝脏原位灌注法,以Nycodenz为介质一步法密度梯度离心成功分离大鼠原代HSCs。细胞得率为1.2×107至2.0×107/只,细胞存活率和纯度均大于90%。在倒置显微镜下观察刚分离的HSCs呈圆形,胞浆中含有较多脂滴,在波长328 nm的荧光显微镜下观察,刚分离的原代HSCs呈自发蓝色荧光。培养至10天,大鼠HSCs呈活化状态,脂滴消失,变成梭形肌成纤维样细胞。②原代HSCs性质鉴定。刚分离的HSCs免疫细胞化学染色α-SMA表达阴性;原代培养10天后α-SMA阳性染色率达100%。③通过反复感染AD293T细胞的方法使病毒扩增获得了实验所需的病毒液(Ad-PTEN、Ad-G129E、Ad-GFP的滴度分别为1.6×109、1.8×109、1.2×109、1.5×109 pfu/ml)。④腺病毒感染HSCs后72 h,应用real time Q-PCR检测两种细胞中PTEN mRNA表达,并采用相对定量2-△△Ct法比较PTEN mRNA在各组HSCs中的表达。原代HSCs组中,以Control组为对照组(其PTEN mRNA表达量为1),则Ad-GFP组、Ad-PTEN组、Ad-G129E组与PTEN shRNA相对Control组的PTEN mRNA表达倍数分别为0.994倍、1.698倍、1.624倍、0.357倍。进一步应用Western blot分析各组原代HSCs的PTEN蛋白表达,Ad-PTEN组(1.91±0.09)、Ad-G129E组(1.74±0.08)均显著高于Control组(1.21±0.05)及Ad-GFP组(1.15±0.04,P<0.01,PTEN shRNA组(0.56±0.04)显著低于Control组及Ad-GFP组;而Control组与Ad-GFP组之间,以及Ad-PTEN组和Ad-G129E组之间均无显著性差异(P>0.05)。证明上述腺病毒成功转染入大鼠原代HSCs,在人LX2中的检测结果与上述相似;⑤MTT检测结果显示,在一定时间范围内,野生型PTEN基因及G129E基因可以抑制原代HSCs及人LX2活化,其中在转染后72 h,Ad-PTEN基因使原代HSCs以及LX2细胞活力分别由对照组的100.00%降低至74.71%、50.43%,G129E基因使原代HSCs以及LX2细胞活力分别由对照组的100.00%降低至83.74%、61.95%;PTENshRNA组细胞活力则分别增至118.26%、142.15%;⑥BrdU法检测结果显示,野生型PTEN基因及G129E基因可以抑制原代HSCs DNA合成,在转染后72 h,同Ad-GFP组相比,Ad-PTEN组与Ad-G129E组DNA合成显著降低,分别降至63.32%、74.75%,PTEN shRNA则显著促进原代HSC DNA合成,增殖率为35.36%;在人HSC-LX2细胞中,Ad-PTEN组与Ad-G129E组细胞DNA合成分别降至42.38%、56.65%,而PTEN shRNA则显著促进细胞DNA合成,增殖率为57.13%;⑦Annexin-V/PE联合标记流式细胞术检测结果显示,重组腺病毒转染大鼠原代HSCs 72 h后,Ad-PTEN组HSCs凋亡率(34.85%±2.11%)、Ad-G129E组凋亡率(25.18%±1.34%)均显著高于Control组(3.12%±0.15%)及Ad-GFP组(4.21%±0.35%),P<0.01;PTEN shRNA组(1.24%±0.08%)显著低于Control组及Ad-GFP组;在人LX2中,Ad-PTEN组与Ad-G129E组细胞凋亡率分别为41.76%±1.98%、37.18%±2.13% ,均显著高于Control组(5.68%±1.15%)及Ad-GFP组(7.21%±1.25%),P<0.01;PTEN shRNA组(2.25%±1.18%)显著低于Control组及Ad-GFP组;⑧Hoechst 33258染色后荧光显微镜下观察发现,无论是大鼠原代HSCs还是人LX2细胞,野生型PTEN基因与Ad-G129E感染HSCs后72 h,均可见凋亡细胞,表现为核染色体浓集呈亮蓝色的碎片状,在细胞边缘聚集分布,细胞边缘不完整;而GFP组细胞及PTEN shRNA组细胞则很少看到上述现象,表现为核染色体呈椭圆形,内有颜色较深的蓝色颗粒,细胞边缘完整清晰;每张细胞片随机选取5个高倍视野,分别计数正常细胞数与凋亡细胞数,每个标本至少计数300个细胞以上,镜下计数细胞凋亡率,结果表明在原代HSCs中,Ad-PTEN组HSCs凋亡率(18.25%±1.23%)、Ad-G129E组凋亡率(15.18%±1.15%)均显著高于Control组(1.12%±0.15%)及Ad-GFP组(1.78%±0.09%) , P<0.01 ; PTEN shRNA组中仅偶见到凋亡细胞(0.33%±0.01%),P<0.01;⑨TUNEL检测结果表明,在腺病毒感染原代HSCs后72 h,Ad-PTEN组HSC凋亡率增至25.82%±1.53%,Ad-G129E组增至19.23%±0.97%,均显著高于Control组(1.22%±0.15%)及Ad-GFP组(1.43%±0.13%),P<0.01;而Ad-PTEN组HSC凋亡率亦明显高于Ad-G129E组(P<0.01);Ad-GFP组与Control组比较无显著差异(P>0.05);⑩Caspase-3活性检测结果表明,过表达野生型PTEN基因与G129E基因可显著增加Caspase-3的活性,在原代HSCs中分别增加至2.16倍和1.73倍,而PTEN shRNA则抑制Caspase-3活性的活性,抑制率为62.13%;在人LX2中,Ad-PTEN与Ad-G129E分别使HSCs的Caspase-3活性增加至2.53倍和1.96倍,PTEN shRNA对人HSCs中Caspase-3活性的抑制率为71.23%;○11Western blot结果显示Ad-PTEN与Ad-G129E显著促进了原代HSCs与人LX2细胞中Bax的表达,抑制了Bcl-2的表达, Bax/Bcl-2比值也相应增加;○12野生型PTEN基因及G129E基因使大鼠原代HSCs和LX2细胞G0/G1期和G2/M期细胞比例上升,S期细胞比例下降;PTEN shRNA作用则与上述相反;○13野生型PTEN基因及G129E基因抑制大鼠原代HSCs和LX2中CyclinD1和CDK4的蛋白表达,促进了P27kip1的表达,PTEN shRNA作用则与上述相反。结论:成功分离大鼠原代HSCs;野生型PTEN基因、G129E基因及PTEN shRNA重组腺病毒可成功转染大鼠原代HSCs以及人LX2;野生型PTEN基因、G129E基因过表达可明显抑制HSCs增殖,诱导HSCs凋亡,增加Caspase-3活性,并引起HSCs的凋亡调控基因Bax表达增加,Bcl-2表达下降,而且野生型PTEN的作用明显强于G129E;PTEN过表达可阻滞HSCs细胞周期时相于G0/G1期,这可能与其抑制CyclinD1、CDK4表达,而上调P27kip1表达有关,而PTEN shRNA转染结果则与野生型PTEN基因、G129E基因相反。第二部分增强与阻断PTEN表达对肝星状细胞胶原代谢的影响目的:探讨过表达的野生型PTEN、其突变体G129E(丧失了脂质磷酸酶活性仅保留蛋白磷酸酶活性)、靶向PTEN的RNA干扰重组腺病毒对大鼠原代HSCs及人肝星状细胞系胶原代谢的影响方法:野生型PTEN、其突变体G129E、PTEN shRNA干预大鼠原代HSCs与人HSC LX2细胞72 h后,采用Western blot技术检测HSCs的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-13、TIMP-1、MMP-2、TIMP-2及GAPDH蛋白表达。结果:①Western blot技术检测大鼠原代HSCs中Ⅰ型胶原的蛋白表达,结果显示:Ad-PTEN组(0.32±0.05)、Ad-G129E组(0.47±0.07)均显著低于Control组(0.85±0.05)及Ad-GFP组(0.82±0.09),P<0.01,且Ad-PTEN组与Ad-G129E组之间具有显著性差异(P<0.05),PTEN shRNA组(1.28±0.13)较Control组与Ad-GFP组显著增加,P<0.01,但Control组与Ad-GFP组之间无明显差异(P>0.05)。对各组原代HSCsⅢ型胶原蛋白表达的检测结果显示,Ad-PTEN组(0.18±0.02)、Ad-G129E组(0.27±0.03)均较Control组(0.41±0.02)及Ad-GFP组(0.38±0.03)显著降低,P<0.01,同时Ad-PTEN组明显低于Ad-G129E组(P<0.05),PTEN shRNA组(0.72±0.07)较Control组与Ad-GFP组显著增加,P<0.01,Control组与Ad-GFP组之间无明显差异(P>0.05)。对人LX2细胞的检测结果与上述相似;②Western blot技术检测大鼠原代HSCs中MMP-13的蛋白表达,结果显示:Ad-PTEN组(0.88±0.06)、Ad-G129E组(0.71±0.12)均显著高于Control组(0.51±0.03)及Ad-GFP组(0.47±0.02),P<0.01,且Ad-PTEN组与Ad-G129E组之间具有显著性差异(P<0.05),PTEN shRNA组(0.36±0.03)较Control组与Ad-GFP组显著降低,P<0.01,但Control组与Ad-GFP组之间无明显差异(P>0.05);对TIMP-1的检测结果显示:Ad-PTEN组(0.17±0.02)、Ad-G129E组(0.26±0.03)均显著低于Control组(0.38±0.06)及Ad-GFP组(0.42±0.03),P<0.01,且Ad-PTEN组与Ad-G129E组之间具有显著性差异(P<0.05),PTEN shRNA组(0.73±0.12)较Control组与Ad-GFP组显著增加,P<0.01,但Control组与Ad-GFP组之间无明显差异(P>0.05)。对人LX2细胞的检测结果与上述相似。③Western blot技术检测大鼠原代HSCs中MMP-2的蛋白表达,结果显示:Ad-PTEN组(0.85±0.07)、Ad-G129E组(0.71±0.02)均显著高于Control组(0.35±0.03)及Ad-GFP组(0.38±0.07),P<0.01,且Ad-PTEN组与Ad-G129E组之间具有显著性差异(P<0.05),PTEN shRNA组(0.16±0.03)较Control组与Ad-GFP组显著降低,P<0.01,但Control组与Ad-GFP组之间无明显差异(P>0.05);对TIMP-2的检测结果显示:Ad-PTEN组(0.34±0.04)、Ad-G129E组(0.48±0.08)均显著低于Control组(0.88±0.08)及Ad-GFP组(0.84±0.06),P<0.01,且Ad-PTEN组与Ad-G129E组之间具有显著性差异(P<0.05),PTEN shRNA组(1.13±0.11)较Control组与Ad-GFP组显著增加,P<0.01,但Control组与Ad-GFP组之间无明显差异(P>0.05)。对人LX2细胞的检测结果与上述相似。结论:外源性野生型PTEN基因及G129E基因在大鼠原代HSCs及人LX2中的过表达可显著抑制HSCs中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达,这可能与其上调MMP-13及MMP-2的表达,抑制TIMP-1及TIMP-2的表达有关;PTEN shRNA作用效果与上述相反。第三部分PTEN调控肝星状细胞生物学行为的信号转导机制目的:探讨PTEN调控大鼠原代肝星状细胞与人LX2细胞增殖、凋亡及细胞周期的信号转导机制。方法:分离培养大鼠原代HSCs,体外培养活化人LX2细胞,以腺病毒为载体将野生型PTEN基因、其突变体G129E基因及PTEN shRNA重组腺病毒瞬时转染体外培养的上述两种细胞;Western blot技术检测HSCs的磷脂酰肌醇-3-激酶PI3K (phosphoinositol-3-kinase, PI3K)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B(serine-threonine protein kinase B, Akt)、p-Akt (Thr308)、黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)、p-FAK (Tyr397)、细胞外信号调节激1(extracellular signal-regulated kinase1, ERK1)、p-ERK1蛋白表达。实验分组同第二部分。结果:①Western blot检测证实外源性野生型PTEN基因及其突变体G129E基因在大鼠原代HSCs大量表达,而PTEN shRNA组PTEN表达显著降低(结果同第二部分);②腺病毒感染上述两种HSCs后72 h,real time Q-PCR检测原代HSCs组中PI3K mRNA表达,结果显示:以Control组为对照组(其PI3K mRNA表达量为1),则Ad-GFP组、Ad-PTEN组、Ad-G129E组与PTEN shRNA相对Control组的PI3K mRNA表达倍数分别为0.979倍、0.716倍、0.962倍、1.223倍,Ad-PTEN组较Control组及Ad-GFP组显著降低,P<0.01,PTEN shRNA组显著升高,与各组相比均有显著性差异,P<0.01,而Ad-G129E组与Control组及Ad-GFP组之间无显著性差异,P>0.05;对人LX2的检测结果与上述趋势相一致;进一步采用Western blot检测PI3K蛋白结果显示:在原代HSCs中,Ad-PTEN组PI3K蛋白表达(0.49±0.02)显著低于Ad-G129E组(0.75±0.06)、Control组(0.82±0.07)及Ad-GFP组(0.79±0.03),P<0.01,PTEN shRNA组(1.12±0.14)显著高于Ad-GFP组与Control组,P<0.01,但Ad-G129E组、Control组及Ad-GFP组之间PI3K表达无显著差别(P>0.05);对人LX2的检测结果与上述趋势相一致;③三种重组腺病毒对HSCs中Akt mRNA及蛋白表达均无明显影响(P>0.05);而p-Akt(Thr308)表达则有显著改变。在原代HSCs中,Ad-PTEN组p-Akt(Thr308)蛋白表达(0.28±0.02)显著低于Ad-G129E组(0.48±0.03)、Control组(0.50±0.02)及Ad-GFP组(0.52±0.05),P<0.01,PTENshRNA组(0.62±0.03)显著高于Ad-G129E组与Control组,P<0.01,但Ad-G129E组、Control组及Ad-GFP组之间p-Akt(Thr308)表达无显著差别(P>0.05);对人LX2的检测结果与上述趋势相一致。④腺病毒感染上述两种HSCs后72 h,real time Q-PCR技术及Western blot检测结果显示三种重组腺病毒对HSCs中总FAK mRNA及蛋白表达均无明显影响(P>0.05);而p-FAK (Tyr397)表达则有显著改变。在原代HSCs中,Ad-PTEN组p-FAK (Tyr397)蛋白表达(0.42±0.05)及Ad-G129E组(0.49±0.07)均显著低于Control组(0.80±0.09)及Ad-GFP组(0.78±0.05),P<0.01,PTEN shRNA组(0.92±0.07)显著高于Ad-GFP组与Control组,P<0.01,但Ad-PTEN组与Ad-G129E组,以及Control组与Ad-GFP组之间p-FAK (Tyr397)表达无显著差异(P>0.05);对人LX2的检测结果与上述趋势相一致。⑤腺病毒感染原代HSCs后72 h,real time Q-PCR技术及Western blot技术检测野生型PTEN及G129E对两种HSCs ERK1 mRNA及蛋白表达表达均无明显影响(P>0.05);而p-ERK1蛋白表达则有显著改变。在原代HSCs中,Western blot显示Ad-PTEN组p-ERK1蛋白表达(0.25±0.02)、Ad-G129E组p-ERK1蛋白表达(0.28±0.07)均显著低于Control组(0.54±0.07)及Ad-GFP组(0.52±0.06),P<0.01,PTEN shRNA组(0.70±0.05)显著高于Ad-G129E组与Control组,P<0.01,但Ad-PTEN组与Ad-G129E组,以及Control组与Ad-GFP组之间p-ERK1表达无显著差异(P>0.05);对人LX2的检测结果与上述趋势相一致。结论:PTEN通过其磷酸酶活性抑制Akt、FAK、ERK1的磷酸化;其抑制HSCs细胞增殖、诱导HSCs凋亡、负性调控HSCs细胞周期、以及抑制HSCs细胞胶原合成的作用与PI3K/Akt、FAK/ERK1/2信号通路的活性抑制有关。第四部分腺病毒介导的PTEN基因防治CCl4诱导的大鼠肝纤维化的实验研究目的:研究PTEN在CCl4诱导的大鼠肝纤维化中的动态改变及应用重组PTEN腺病毒对CCl4诱导的大鼠肝纤维化的防治作用方法:采用成年健康雄性Wistar大鼠128只,随机分成预防组(Prevention groups,简写为Pre)(Pre 1 wk、Pre 3 wk、Pre 5 wk和Pre 7 wk组,每组15只)、治疗组(Treatment groups,简写为Tre)(Tre 1 wk、Tre 2wk、Tre 3 wk和Tre 4 wk组,每组15只)和正常对照组(8只),其中根据导入重组腺病毒的不同,预防组与治疗组每个时间点又分为如下5组(CCl4组;CCl4+Ad-GFP组;CCl4+Ad-PTEN组;CCl4+Ad-G129E组;CCl4+PTEN shRNA组),进行四肢轮流皮下注射40% CCl4橄榄油溶液(2 ml·kg-1,2次/周),造模时间共7周,预防组自第1周开始、治疗组自第4周开始在注射CCl4前分别自尾静脉注射Ad-GFP、Ad-PTEN、Ad-G129E、PTEN shRNA重组腺病毒,每周给药一次。自动生化仪检测大鼠肝功能改变;采用Haematoxylin and eosin staining(HE染色)、Masson’s trichrome staining(MT染色)方法观察肝脏病理学改变,免疫组织化学、免疫荧光方法、Western blot技术检测大鼠肝组织中PTEN及α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)的表达;采用免疫荧光双标记法、激光扫描共聚焦显微镜观察在体活化HSCs以及凋亡细胞中PTEN的表达改变;末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记(TUNEL)及α-SMA免疫荧光双标记方法检测在体活化HSCs的凋亡;免疫组织化学、Western blot技术检测Ⅰ、Ⅲ型胶原在各组大鼠肝组织中的动态表达。结果:①Ad-PTEN、G129E重组腺病毒注射后纤维化大鼠精神状态、进食水量及活动量较CCl4模型组好转,而PTEN shRNA腺病毒注射后纤维化大鼠精神萎靡、活动减少;②对大鼠肝功能的分析结果显示:各预防组及治疗组大鼠给予重组腺病毒野生型PTEN、其突变体G129E干预后,大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平较CCl4模型组显著降低,肝功能有所改善;而采用RNAi技术阻断PTEN表达则加重纤维化大鼠的肝脏损害;③HE染色显示,无论是预防组还是治疗组,给予Ad-PTEN和Ad-G129E干预后各组大鼠肝细胞变性坏死、炎症细胞浸润均明显减轻,Ad-PTEN作用效果优于Ad-G129E,而PTEN shRNA组则较CCl4组及Ad-GFP组出现更为严重的肝细胞脂肪变性及炎症细胞浸润;Masson染色显示,给予Ad-PTEN与Ad-G129E干预后大鼠肝组织汇管区内仍有少量纤维组织生成,有短的纤维间隔伸入肝小叶,且随着造模时间延长,其肝纤维化程度也呈现逐渐加重的趋势,但与同一造模时间点的CCl4模型组与Ad-GFP对照组大鼠相比,其纤维化程度明显减轻;④PTEN免疫组织化学、免疫荧光染色显示,同CCl4组及Ad-GFP组相比,无论是预防组(Pre 1 wk～Pre 7 wk)还是治疗组(Tre 1 wk～Tre 4 wk)肝纤维化模型中,给予Ad-PTEN与Ad-G129E重组腺病毒干预后,肝组织中PTEN表达均显著增多,且肝组织中表达PTEN的细胞主要分布于汇管区与中央静脉周围;进一步采用Western blot技术检测PTEN在各组大鼠肝组织中的蛋白表达,结果显示给予Ad-PTEN与Ad-G129E重组腺病毒干预后肝组织中PTEN蛋白表达明显增多,而PTEN shRNA干预后大鼠肝组织中PTEN蛋白明显降低,表明以上三种重组腺病毒成功导入了纤维化大鼠体内;⑤α-SMA免疫组织化学、免疫荧光染色显示,给予Ad-PTEN与Ad-G129E干预后各造模时间点大鼠肝组织中α-SMA表达水平较Ad-GFP组与CCl4组显著降低,且Ad-PTEN对α-SMA的抑制作用强于Ad-G129E,进一步采用Western blot技术检测α-SMA蛋白在各组大鼠肝组织中的表达亦支持上述结论;进一步采用免疫荧光双重染色,激光扫描共聚焦显微镜观察活化HSCs中PTEN的表达变化,发现给予Ad-PTEN及Ad-G129E腺病毒干预后,同Ad-GFP组及CCl4组相比,活化HSCs中PTEN表达显著增加,且Ad-PTEN组中更为显著,P<0.05;给予PTEN shRNA腺病毒干预后,大鼠肝组织中活化HSCs中PTEN表达显著降低,P<0.01,说明PTEN高表达可抑制纤维化大鼠肝组织中HSCs的活化;⑥共聚焦激光扫描显微镜下观察TUNEL及α-SMA免疫荧光双重染色结果显示,给予Ad-PTEN与Ad-G129E重组腺病毒干预后,预防组自第3周始、治疗组从干预后第1周开始,活化HSCs数量显著增多,其中Ad-PTEN组作用效果优于Ad-G129E,而给予PTEN shRNA干预后大鼠肝组织中活化HSCs数量显著降低,说明PTEN的高表达能诱导活化HSCs的凋亡;⑦免疫组织化学与Western blot技术检测各组大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达,结果显示给予Ad-PTEN与Ad-G129E干预后各造模时间点大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平较Ad-GFP组与CCl4组显著降低,且Ad-PTEN对Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的抑制作用强于Ad-G129E,而给予PTEN shRNA干预后大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达显著增加,说明PTEN的高表达能够抑制HSCs中Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成;⑧Pearson’s相关性分析表明,大鼠纤维化肝组织中PTEN表达与α-SMA表达呈显著负相关,与PTEN阳性的活化HSCs比例呈显著正相关,与活化HSCs凋亡指数呈显著正相关。结论:采用CCl4皮下注射法可建立稳定可靠的肝纤维化大鼠模型,PTEN可能参与大鼠肝纤维化的发生发展;尾静脉导入野生型PTEN基因、Ad-G129E基因及PTEN shRNA基因可有效的感染肝纤维化模型大鼠,并可在肝纤维化大鼠中正确表达;野生型PTEN基因、G129E基因高表达可改善纤维化大鼠的肝功能、抑制大鼠肝组织中HSCs活化并促进其凋亡并抑制纤维化大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成,从而减轻大鼠肝纤维化的进展,PTEN可能是防治肝纤维化的一个有效靶点。