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丝纤维是自然界中最神秘、最吸引人的材料之一，被广泛应用于生物医学、软组织工程、生物传感器、纺织品、化妆品等领域。自然界中有超过23种目的昆虫和4万余种蜘蛛分泌丝纤维。通常，泌丝动物会营茧筑巢来保护自己，或者吐丝织网来捕获猎物。家蚕和棒络新妇蜘蛛是研究最多的两种泌丝动物。天然蜘蛛丝具有非凡的力学性能，比如高拉伸强度和韧性。然而蜘蛛极具侵略性，不群居，使得通过大规模繁殖蜘蛛来获得天然蜘蛛丝很难实现。为此，研究人员在开发重组蜘蛛丝蛋白方面做出了巨大努力，包括在细菌、酵母、植物和转基因动物等生物反应器中表达重组蜘蛛丝蛋白。但是，受蛋白产量、溶解性、稳定性、人工纺丝工艺等因素限制，体外获得的重组蜘蛛丝始终难以达到天然蜘蛛丝的品质。从嫘祖始蚕到现今，家蚕经过了5000多年的驯化历史，天然蚕丝也因其舒适和光泽深受广大人民的喜爱。家蚕是重要的经济昆虫，也是研究鳞翅目昆虫和节肢动物的模式生物。家蚕喜群居，可大规模饲养，而且家蚕的丝蛋白产量非常高，一只干重约2g的蚕，其丝腺可产生多达500mg的丝蛋白，约占其自身干重的25%。丝蛋白以可溶且高浓度(高达25%)的形式储存在丝腺腔中而不发生蛋白聚集和变性。这种超凡的蛋白质合成和储存能力为蚕丝的研究和利用提供了广阔的前景。
丝蛋白的合成和分泌是受精密控制的动态过程。丝蛋白从后部丝腺向前部丝腺运输的过程中，丝胶蛋白层层包裹丝素蛋白形成了丝蛋白在丝腺腔中的有序组装模式。这种有序组装模式，造就了丝纤维在内具有强度和韧性，在外具有黏度和亲水性。家蚕丝腺腔具有pH梯度，从后部丝腺到前部丝腺，其pH从8.2降到6.2，具有从碱到酸的变化过程。不仅如此，丝腺腔中的离子也具有梯度变化，从家蚕中部丝腺后段到中部丝腺前段，Na、K、Mg、Cu、Zn元素的含量逐渐增加，Ca元素的含量逐渐减少。那么丝腺腔中发生的有序组成和梯度变化，是如何形成和调控的呢？本研究选取家蚕5龄成熟期幼虫的丝腺作为研究对象，通过将单根丝腺进行精细分段，运用转录组测序分析并筛选参与丝蛋白合成分泌以及丝纤维形成机制的梯度表达基因，并在个体水平上调控候选的梯度表达基因，探索其对丝蛋白合成的影响。主要研究结果如下：
1.家蚕单根丝腺精细分段的转录组分析
为了深入解析丝蛋白合成的遗传基础，我们运用RNA-seq技术对精细分段的单根丝腺样品进行测序分析，其中中部丝腺分三组样品：MSG-A、MSG-M、MSG-P；后部丝腺分四组样品：PSG-1、PSG-2、PSG-3、PSG-4。我们将FPKM值≥5的基因定义为表达基因。结果显示，MSG三组样品的表达基因数分别为3658，2860，2888，PSG四组样品的表达基因数分别为2987，2778，3720，2658。进一步筛选比较分析发现，我们在七组丝腺分段样品中共鉴定到3121个差异表达基因(Differentially expressed genes，DEGs)。使用pheatmap对DEGs进行层次聚类分析，发现这些DEGs在丝腺中呈明显的组织特异性表达特征，其中MSG-A中差异基因的表达水平最高。使用TCseq对所有DEGs进行共表达分析，鉴定到430个MSG-A高表达基因，252个MSG高表达基因，544个PSG高表达基因，773个表达量呈梯度递增变化的基因。
针对MSG-A中特异且高量表达的基因做KEGG通路富集分析发现，色氨酸代谢通路、乙醛酸和二羧酸盐代谢通路、FoxO信号通路和过氧化物酶体通路均被显著富集。将MSG的高表达基因与PSG的高表达基因对比分析，GO注释显示MSG高表达组的基因主要参与脂质代谢、脂质转运、细胞进程的负调控、去磷酸化和抗生素代谢，PSG高表达组的基因主要参与大分子分解代谢、乙醇代谢、囊泡介导的转运、化学稳态和蛋白酶体组装。将MSG高表达组和PSG高表达组的KEGG通路显著富集情况进行共展示发现，多数KEGG通路都被MSG和PSG共同富集到，包括三羧酸循环通路、糖酵解/糖异生通路、碳代谢通路、脂肪酸代谢通路、氨基酸的生物合成通路、嘧啶代谢通路、内吞作用通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路、过氧化物酶体通路、RNA转运通路、凋亡通路。不饱和脂肪酸的生物合成通路和溶酶体通路仅在MSG高表达组被富集到；酪氨酸代谢通路、核糖体通路、蛋白酶体通路、谷胱甘肽代谢通路仅在PSG高表达组被富集到。这些结果暗示在五龄成熟期幼虫丝腺中，MSG和PSG都参与大量的氨基酸代谢和能量代谢。除此以外，我们还鉴定到9个脂质代谢相关基因和1个脂质转运相关基因在MSG高量表达，表明MSG参与脂质的利用。
我们将从PSG到MSG表达量呈逐渐增加趋势的基因称之为梯度表达基因。为明确它们在丝蛋白合成及分泌过程中涉及的生物学途径，我们对梯度表达组所有的差异基因采用KEGG通路富集分析，一共鉴定到17条显著富集的通路(q-value<0.05)。结果显示，这17条显著富集的KEGG通路大致可归为三类：能量代谢相关通路、蛋白质合成相关通路、蛋白质分泌相关通路。其中能量代谢相关通路有4个：磷酸戊糖途径、2-氧代羧酸代谢通路、糖酵解和糖异生通路、碳代谢通路；蛋白质合成相关通路有7个：苯丙氨酸代谢通路、氨酰tRNA生物合成通路、剪接体通路、内质网蛋白质加工通路、mRNA监测通路、RNA降解通路、RNA运输通路；蛋白质分泌相关通路有2个：N-聚糖生物合成通路、蛋白质输出通路。这些结果表明，蛋白合成和分泌是5龄成熟期幼虫丝腺的主要活动。另外，GO富集分析的结果显示，质子转运ATPase活性在丝腺中是最显著富集的。我们在丝腺中鉴定到33种H+-transportingATPase，其中有7种V型H+-transportingATPase具有上升梯度表达特征。随后，我们使用离子选择性微电极(ion-selective microelectrode，ISM)测定丝腺细胞的pH，结果表明从PSG到ASG，丝腺细胞也存在着pH梯度。PSG细胞的pH在8.05-8.2范围内，呈碱性；从MSG到ASG的前端，丝腺细胞的pH从7.8降到7.6，呈弱碱性。
2.碳酸酐酶调控丝腺pH梯度的研究
碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA)可以高效的催化CO2的水合反应来调节pH。我们在丝腺中鉴定到两个碳酸酐酶基因：BMgn002647和BMgn003357。BMgn002647注释为血细胞碳酸酐酶(erythrocyte carbonic anhydrase)，简写为CA2，其与人源CA1的相似性为46.07%，与人源CA2的相似性为45.69%。进化树分析显示鳞翅目间的CA2基因亲缘关系较近。BMgn003357注释为β碳酸酐酶1(βcarbonicanhydrase1)，简写为β-CA1，其与果蝇属β-CA相似性为71.76%，进化树分析显示鳞翅目间的β-CA1基因亲缘关系较近。五龄第7天的组织表达谱显示BMgn002647在表皮、血细胞中高表达，在丝腺中的表达量较低；BMgn003357也在表皮、血细胞中高表达，但其在丝腺中的表达量相对较高。
我们获得了BMgn002647和BMgn003357基因分别在ASG、MSG和PSG中过表达的突变个体，转录水平和蛋白水平检测显示，靶基因均实现一定程度的过表达。茧层率统计结果显示，在ASG和MSG过表达两种碳酸酐酶，茧层率均无明显变化。而在PSG过表达两种碳酸酐酶，茧层率显著提高。PSG过表达BMgn002647基因，茧层率增加1.28-1.7个百分点；PSG过表达BMgn003357基因，茧层率增加0.69-2.3个百分点。利用ISM检测PSG细胞的pH发现，过表达BMgn002647基因导致PSG的pH由7.8-8.0降到7.3-7.5，即由碱性变成偏中性。定量检测丝蛋白的表达水平发现，过表达BMgn002647基因引起Fib-H的表达量升高。这暗示调节PSG的pH可以促进丝蛋白的分泌。
3.候选梯度表达基因——血管紧张素转换酶BmACE对丝蛋白合成的影响
血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)在人体中具有升高血压和调节离子平衡的效果。我们在丝腺中鉴定到一个表达量具有递增梯度表达模式的ACE基因，基因编号为BMgn006539。BmACE与人源ACE的氨基酸相似度为24.02%，与果蝇属ACE的相似度为22.52%，它们的关键结构域部分的氨基酸序列相似度较高。组织时期表达谱显示，BmACE基因在丝腺和精巢中特异高表达，在眠期和吐丝48h表达量最高。
运用CRISPRa上调表达技术，我们在细胞水平筛选到一个能显著上调BmACE基因表达量的gRNA，注射并获得了在PSG上调表达BmACE基因的突变品系。同时，运用传统过表达手段，我们获得了分别在ASG、MSG和PSG过表达BmACE基因的突变品系。定量检测显示，无论是基于CRISPRa还是过表达技术，BmACE基因均实现有效提高。茧层率统计结果显示，在ASG和MSG过表达BmACE基因，茧层率均无明显变化。而当提高BmACE基因在PSG的表达量时，茧层率显著提高。其中PSG过表达BmACE基因，茧层率增加0.52-1.16个百分点；PSG上调表达BmACE基因，茧层率增加1.16-2.3个百分点。这暗示提高PSG中BmACE基因的表达量，能促进丝蛋白合成。
4.候选梯度表达基因——网状内皮素BmRTN3L对丝蛋白合成的影响
网状内皮素(reticulon，RTN)主要定位于内质网，可促进内质网膜的曲率。我们在丝腺中鉴定到一个表达量呈递增梯度变化的BmRTN3L基因，基因编号为BMgn005860。组织表达谱检测显示，BmRTN3L基因在血细胞中高表达，在丝腺中相对低表达。运用CRISPR/cas9敲除技术，我们在细胞水平筛选到一个敲除效率较高的gRNA，注射并与nanos-cas9品系杂交，获得稳定遗传的BmRTN3L基因敲除品系。测序结果显示，F1代的敲除效率高达42.86%-74.28%，敲除形式以短片段敲除为主。定量结果显示，MSG中BmRTN3L基因被显著敲除，mRNA水平下降25.24%。丝蛋白的定量结果显示，Ser2基因的表达量降低，Ser3基因的表达量升高。表型观察发现，F1代茧壳变薄，茧层率显著降低2.03-5.74个百分点。这表明敲除BmRTN3L基因导致丝蛋白合成受阻。
综合以上研究结果，本研究利用转录组测序技术筛选到一大类参与丝蛋白合成和分泌的梯度表达基因，并通过调控丝腺pH以及候选梯度表达基因来探究丝蛋白合成分泌的影响因素。本研究将为阐明丝蛋白合成分泌机制以及提高丝蛋白的产量提供新的思路。
丝蛋白的合成和分泌是受精密控制的动态过程。丝蛋白从后部丝腺向前部丝腺运输的过程中，丝胶蛋白层层包裹丝素蛋白形成了丝蛋白在丝腺腔中的有序组装模式。这种有序组装模式，造就了丝纤维在内具有强度和韧性，在外具有黏度和亲水性。家蚕丝腺腔具有pH梯度，从后部丝腺到前部丝腺，其pH从8.2降到6.2，具有从碱到酸的变化过程。不仅如此，丝腺腔中的离子也具有梯度变化，从家蚕中部丝腺后段到中部丝腺前段，Na、K、Mg、Cu、Zn元素的含量逐渐增加，Ca元素的含量逐渐减少。那么丝腺腔中发生的有序组成和梯度变化，是如何形成和调控的呢？本研究选取家蚕5龄成熟期幼虫的丝腺作为研究对象，通过将单根丝腺进行精细分段，运用转录组测序分析并筛选参与丝蛋白合成分泌以及丝纤维形成机制的梯度表达基因，并在个体水平上调控候选的梯度表达基因，探索其对丝蛋白合成的影响。主要研究结果如下：
1.家蚕单根丝腺精细分段的转录组分析
为了深入解析丝蛋白合成的遗传基础，我们运用RNA-seq技术对精细分段的单根丝腺样品进行测序分析，其中中部丝腺分三组样品：MSG-A、MSG-M、MSG-P；后部丝腺分四组样品：PSG-1、PSG-2、PSG-3、PSG-4。我们将FPKM值≥5的基因定义为表达基因。结果显示，MSG三组样品的表达基因数分别为3658，2860，2888，PSG四组样品的表达基因数分别为2987，2778，3720，2658。进一步筛选比较分析发现，我们在七组丝腺分段样品中共鉴定到3121个差异表达基因(Differentially expressed genes，DEGs)。使用pheatmap对DEGs进行层次聚类分析，发现这些DEGs在丝腺中呈明显的组织特异性表达特征，其中MSG-A中差异基因的表达水平最高。使用TCseq对所有DEGs进行共表达分析，鉴定到430个MSG-A高表达基因，252个MSG高表达基因，544个PSG高表达基因，773个表达量呈梯度递增变化的基因。
针对MSG-A中特异且高量表达的基因做KEGG通路富集分析发现，色氨酸代谢通路、乙醛酸和二羧酸盐代谢通路、FoxO信号通路和过氧化物酶体通路均被显著富集。将MSG的高表达基因与PSG的高表达基因对比分析，GO注释显示MSG高表达组的基因主要参与脂质代谢、脂质转运、细胞进程的负调控、去磷酸化和抗生素代谢，PSG高表达组的基因主要参与大分子分解代谢、乙醇代谢、囊泡介导的转运、化学稳态和蛋白酶体组装。将MSG高表达组和PSG高表达组的KEGG通路显著富集情况进行共展示发现，多数KEGG通路都被MSG和PSG共同富集到，包括三羧酸循环通路、糖酵解/糖异生通路、碳代谢通路、脂肪酸代谢通路、氨基酸的生物合成通路、嘧啶代谢通路、内吞作用通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路、过氧化物酶体通路、RNA转运通路、凋亡通路。不饱和脂肪酸的生物合成通路和溶酶体通路仅在MSG高表达组被富集到；酪氨酸代谢通路、核糖体通路、蛋白酶体通路、谷胱甘肽代谢通路仅在PSG高表达组被富集到。这些结果暗示在五龄成熟期幼虫丝腺中，MSG和PSG都参与大量的氨基酸代谢和能量代谢。除此以外，我们还鉴定到9个脂质代谢相关基因和1个脂质转运相关基因在MSG高量表达，表明MSG参与脂质的利用。
我们将从PSG到MSG表达量呈逐渐增加趋势的基因称之为梯度表达基因。为明确它们在丝蛋白合成及分泌过程中涉及的生物学途径，我们对梯度表达组所有的差异基因采用KEGG通路富集分析，一共鉴定到17条显著富集的通路(q-value<0.05)。结果显示，这17条显著富集的KEGG通路大致可归为三类：能量代谢相关通路、蛋白质合成相关通路、蛋白质分泌相关通路。其中能量代谢相关通路有4个：磷酸戊糖途径、2-氧代羧酸代谢通路、糖酵解和糖异生通路、碳代谢通路；蛋白质合成相关通路有7个：苯丙氨酸代谢通路、氨酰tRNA生物合成通路、剪接体通路、内质网蛋白质加工通路、mRNA监测通路、RNA降解通路、RNA运输通路；蛋白质分泌相关通路有2个：N-聚糖生物合成通路、蛋白质输出通路。这些结果表明，蛋白合成和分泌是5龄成熟期幼虫丝腺的主要活动。另外，GO富集分析的结果显示，质子转运ATPase活性在丝腺中是最显著富集的。我们在丝腺中鉴定到33种H+-transportingATPase，其中有7种V型H+-transportingATPase具有上升梯度表达特征。随后，我们使用离子选择性微电极(ion-selective microelectrode，ISM)测定丝腺细胞的pH，结果表明从PSG到ASG，丝腺细胞也存在着pH梯度。PSG细胞的pH在8.05-8.2范围内，呈碱性；从MSG到ASG的前端，丝腺细胞的pH从7.8降到7.6，呈弱碱性。
2.碳酸酐酶调控丝腺pH梯度的研究
碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA)可以高效的催化CO2的水合反应来调节pH。我们在丝腺中鉴定到两个碳酸酐酶基因：BMgn002647和BMgn003357。BMgn002647注释为血细胞碳酸酐酶(erythrocyte carbonic anhydrase)，简写为CA2，其与人源CA1的相似性为46.07%，与人源CA2的相似性为45.69%。进化树分析显示鳞翅目间的CA2基因亲缘关系较近。BMgn003357注释为β碳酸酐酶1(βcarbonicanhydrase1)，简写为β-CA1，其与果蝇属β-CA相似性为71.76%，进化树分析显示鳞翅目间的β-CA1基因亲缘关系较近。五龄第7天的组织表达谱显示BMgn002647在表皮、血细胞中高表达，在丝腺中的表达量较低；BMgn003357也在表皮、血细胞中高表达，但其在丝腺中的表达量相对较高。
我们获得了BMgn002647和BMgn003357基因分别在ASG、MSG和PSG中过表达的突变个体，转录水平和蛋白水平检测显示，靶基因均实现一定程度的过表达。茧层率统计结果显示，在ASG和MSG过表达两种碳酸酐酶，茧层率均无明显变化。而在PSG过表达两种碳酸酐酶，茧层率显著提高。PSG过表达BMgn002647基因，茧层率增加1.28-1.7个百分点；PSG过表达BMgn003357基因，茧层率增加0.69-2.3个百分点。利用ISM检测PSG细胞的pH发现，过表达BMgn002647基因导致PSG的pH由7.8-8.0降到7.3-7.5，即由碱性变成偏中性。定量检测丝蛋白的表达水平发现，过表达BMgn002647基因引起Fib-H的表达量升高。这暗示调节PSG的pH可以促进丝蛋白的分泌。
3.候选梯度表达基因——血管紧张素转换酶BmACE对丝蛋白合成的影响
血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)在人体中具有升高血压和调节离子平衡的效果。我们在丝腺中鉴定到一个表达量具有递增梯度表达模式的ACE基因，基因编号为BMgn006539。BmACE与人源ACE的氨基酸相似度为24.02%，与果蝇属ACE的相似度为22.52%，它们的关键结构域部分的氨基酸序列相似度较高。组织时期表达谱显示，BmACE基因在丝腺和精巢中特异高表达，在眠期和吐丝48h表达量最高。
运用CRISPRa上调表达技术，我们在细胞水平筛选到一个能显著上调BmACE基因表达量的gRNA，注射并获得了在PSG上调表达BmACE基因的突变品系。同时，运用传统过表达手段，我们获得了分别在ASG、MSG和PSG过表达BmACE基因的突变品系。定量检测显示，无论是基于CRISPRa还是过表达技术，BmACE基因均实现有效提高。茧层率统计结果显示，在ASG和MSG过表达BmACE基因，茧层率均无明显变化。而当提高BmACE基因在PSG的表达量时，茧层率显著提高。其中PSG过表达BmACE基因，茧层率增加0.52-1.16个百分点；PSG上调表达BmACE基因，茧层率增加1.16-2.3个百分点。这暗示提高PSG中BmACE基因的表达量，能促进丝蛋白合成。
4.候选梯度表达基因——网状内皮素BmRTN3L对丝蛋白合成的影响
网状内皮素(reticulon，RTN)主要定位于内质网，可促进内质网膜的曲率。我们在丝腺中鉴定到一个表达量呈递增梯度变化的BmRTN3L基因，基因编号为BMgn005860。组织表达谱检测显示，BmRTN3L基因在血细胞中高表达，在丝腺中相对低表达。运用CRISPR/cas9敲除技术，我们在细胞水平筛选到一个敲除效率较高的gRNA，注射并与nanos-cas9品系杂交，获得稳定遗传的BmRTN3L基因敲除品系。测序结果显示，F1代的敲除效率高达42.86%-74.28%，敲除形式以短片段敲除为主。定量结果显示，MSG中BmRTN3L基因被显著敲除，mRNA水平下降25.24%。丝蛋白的定量结果显示，Ser2基因的表达量降低，Ser3基因的表达量升高。表型观察发现，F1代茧壳变薄，茧层率显著降低2.03-5.74个百分点。这表明敲除BmRTN3L基因导致丝蛋白合成受阻。
综合以上研究结果，本研究利用转录组测序技术筛选到一大类参与丝蛋白合成和分泌的梯度表达基因，并通过调控丝腺pH以及候选梯度表达基因来探究丝蛋白合成分泌的影响因素。本研究将为阐明丝蛋白合成分泌机制以及提高丝蛋白的产量提供新的思路。