论文部分内容阅读
蚕丝作为一种来源于家蚕(Bombyx mori)的天然高分子材料，以其优异的性能而闻名，并因其作为可应用于骨组织工程的生物材料而受到人们的关注。然而天然蚕丝材料尚不能满足骨组织工程生物材料某些特定的需求，例如天然丝材料缺乏骨相关生长因子与合适降解速率。骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP-2)是骨组织再生过程中不可或缺的生长因子，其已经被广泛应用于蚕丝生物材料研究领域。迄今为止，不同的偶联方案已被用于赋予多孔3D海绵、膜、微粒和电纺丝垫等丝素创制材料新功能和能够释放出BMP-2。丝素生物材料与BMP-2的偶联多采用非共价偶联的策略，这种结合方式在生物材料使用的最初几天易引起BMP-2发生“突释”现象。因此，如何能够在赋予蚕丝生物材料新功能情况下并能够控制功能蛋白或因子的释放成为这类蚕丝材料应用研究的热点和难点。
虽然通过直接添食、化学改性、中尺度组装和大尺度混合等改性方法，能够实现赋予蚕丝材料新的所需功能，但是这些策略需要每次使用时对材料进行复杂的改性实验而且很难保证获得的每批材料的改性一致性。家蚕种系转化(germline transformation)作为一种可赋予丝素新功能的策略而受到了广泛的关注。家蚕种系转化方法通过将外源基因插入家蚕基因组可获得能吐出具有新功能蚕丝的转基因家蚕个体，而且这种经外源基因插入而获得的特性可以在转基因家蚕个体稳定维持并遗传给后代。因此，通过转基因家蚕特异在丝腺表达功能蛋白能够赋予蚕丝新功能并能稳定遗传给后代，这个方法有望能有效克服其他改性方法的缺点。
最近，人们特别重视智能药物传递系统，该系统响应组织环境信号并根据细胞需求释放生长因子，即所谓的“随需释放”。随需释放可以通过在传递系统中引入刺激响应组件来设计。最常用的触发机制涉及利用酶来裂解固定生长因子的连接物(linker)，从而导致封装生长因子的释放。基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinases-2, MMP-2)是在骨形成或再生过程中广泛存在的一种重要酶。如果在BMP-2两端添加MMP-2可酶解的linkers，在骨再生微环境中广泛存在的MMP-2酶作用下，有望实现在骨组织工程中BMP-2控制释放或随需释放以及控制蚕丝支架的降解速率。
基于以上考虑，本研究拟联合家蚕转基因技术、丝腺高效表达系统和上面提及的药物“随需释放”策略创制新的能用于骨组织工程的功能蚕丝材料。因此，研究中我们首先设计了一个在家蚕后部丝腺特异表达的融合结构，该融合结构表达获得的融合蛋白是将两端含有MMP-2linker的BMP-2分别与丝素重链N端和C端相连接；其次利用家蚕种系转化技术创制了基因组上含有上面设计的家蚕后部丝腺特异表达的融合结构的转基因家蚕品系；最后对获得家蚕转基因品系的家蚕吐出的新型蚕丝进行表征研究。研究结果表明通过我们的策略获得功能性蚕丝可以有效克服目前通过蚕丝改性而获得功能性蚕丝的缺点，同时也为控制蚕丝scaffolds在骨再生工程中的降解提供了一种新的策略。本研究获得的主要研究结果总结如下:
1.随需释放”BMP-2融合蛋白结构的设计及其家蚕丝腺表达系统载体的构建
首先根据家蚕基因组表达基因密码子偏好性对人骨形态发生蛋白BMP-2基因序列进行优化并商业合成hBMP-2；其次是根据文献报道选择了MMP-2酶解活性高(-PAGLWA-)、中(-PLGLWA-)、低(-VLGLWA-)三种不同的linkers作为BMP-2两侧的MMP-2酶解序列；最后是为了保证融合蛋白高量表达，选择了Fib-H的完整的N端和C端作为3种不同linker-hBMP-2-linker结构的两端。基于以上三点进一步完成了家蚕丝腺表达系统载体的设计和构建，具体如下：在hBMP-2基因的两端均成功连接了编码MMP-2linker的核苷酸序列，共获得产生3种不同linker-hBMP-2-linker的靶基因序列，分别命名为B1、B2和B3；家蚕丝腺表达系统载体的构建是基于本课组之前报道的丝素蛋白重链表达系统R3(Zhao et al， 2010)，分别用B1、B2、B3基因替换R3系统中的EGFP片段，成功构建了3个融合基因heavy-chain-B1、heavy-chain-B2和heavy-chain-B3。这3个融合基因包含2304-bp的Fib-HP3序列(含有重链5’上游序列、外显子1、内含子和外显子2的5’端序列)、1206-bp的B1、B2或B3序列以及333-bp的LBS序列(含有重链外显子2的3’端序列和poly-A序列)。随后将上述融合基因分别克隆至piggyBac转座载体中，得到pBac[3xP3-DsRed]-B1、pBac[3xP3-DsRed]-B2和pBac[3xP3-DsRed]-B3。DNA测序结果显示3个转基因载体构建正确。
2.转基因家蚕的创制与分析
利用胚胎显微注射的家蚕种系转化技术平台，将3个重组piggyBac转基因载体导入蚕卵，并利用带有DsRed滤光片的荧光体视显微镜筛选在眼睛中表达DsRed荧光的转基因后代个体。筛选结果显示，注射pBac[3xP3-DsRed]-B1、pBac[3xP3-DsRed]-B2和pBac[3xP3-DsRed]-B3的G1代蛾区中含有DsRed荧光表达的蛾区阳性率分别为13.4%、19%和6.3%。提取DsRed阳性蚕蛾的基因组DNA，经PCR分析结果证实了转基因在家蚕基因组中的整合。随后分别提取野生型和G1转基因蚕茧总蛋白，经SDS-PAGE和hBMP-2抗体免疫印迹法进行检测，结果在3种不同转基因蚕茧总蛋白中均分别检测到了单一的杂交信号，而野生型蚕茧总蛋白中没有检测到任何杂交信号条带，从而证实BMP-2在3种转基因蚕茧中均有表达。估算转基因蚕茧中表达的3种不同类型BMP-2蛋白B1、B2和B3的含量分别为7.2%、10.05%和5.87%。上述研究结果表明，heavy-chain-B1、heavy-chain-B2和heavy-chain-B3融合蛋白与丝素一起成功分泌至后部丝腺腔，并作为丝纤维的外源成分随丝蛋白一起分泌至蚕茧。
3.在丝素中加入可切割的MMPlinker也是一种具有前景的调控丝素降解的策略
将丝素加工成不同的形态已经在组织工程中得到了广泛的应用，因此评估这些过程对外源蛋白含量的影响具有重要意义。将经蚕茧脱胶处理后制成的天然丝素切片和利用丝素溶液经再生制备的水凝胶、膜和冻干粉等不同形态的材料用LISCN溶液再溶解并经Westernblotting分析，结果表明利用丝素溶液制作水凝胶、膜和冻干粉的再生过程中，材料中的hBMP-2含量与初始含量相比分别降低了40%、52%和60%；而天然丝素切片中BMP-2的剩余含量(80%)仍足以用于后续实验。因此，我们采用丝素切片进行后续实验。
我们将丝素切片植入家兔皮下，H&E染色结果显示植入后4周内出现细胞浸润现象，并判断观察到的细胞可能是炎症细胞。因此，我们使用明胶酶谱法检测了炎症细胞(包括单核细胞、未极化和极化的巨噬细胞M1)中MMP-2酶的存在和活性。结果表明，单核细胞和巨噬细胞分泌的MMP-2酶均呈时间依赖性。我们测定获得了表观分子量分别为62-kDa和72-kDa的2种条带，其中72-kDa条带为前体形式的MMP-2酶，62-kDa条带为活性形式的MMP-2酶。单核细胞THP1和未极化的巨噬细胞仅分泌前体MMP-2酶。巨噬细胞极化后第5天检测到少量的活性MMP-2酶，而第7天在巨噬细胞M1的条件培养基中检测到大量的活性MMP-2酶。调控骨愈合不同阶段的不同类型细胞主要包括巨噬细胞、成骨细胞和破骨细胞。特别值得注意的是，巨噬细胞已被证明是丝材料植入后的第一个应答者。我们的研究结果表明，巨噬细胞M1可以作为MMP-2酶的廉价来源和MMP介导降解研究的体外模型。
将无菌丝素切片分别置于不含或含有炎症性巨噬细胞M1的培养基中共培养4周。通过测量丝素切片的质量变化来监测丝素在培养基中的降解情况，并利用扫描电镜观察丝素切片的形态变化。将丝素切片与巨噬细胞M1共培养至M1开始分泌MMP-2后的前3天，各组丝素切片降解率无明显差异，推测可能原因是MMP-2酶仍处于前体状态。而将丝素切片与M1共培养7天后，培养基中MMP-2酶的数量和活性已经能够导致不同处理组丝素切片的降解速率发生差异。共培养28天后，与具有中等催化活性(B2，23.40%)和低催化活性(B3， 11.93%)的丝素切片相比，具有高催化活性的丝素切片质量损失较大(B1，38.07%)。而在无细胞培养基中，丝素切片的干重降低幅度极小甚至为0，从而证实了丝素切片的降解可能是由巨噬细胞分泌的MMP-2酶所介导。扫描电镜形态分析表明，MMP-2linker的加入在一定程度上促进了丝素重链的降解。野生型丝素切片仍保持原有结构，而转基因TSL-B1、TSL-B2、TSL-B3切片表面均出现颗粒碎片。
4.BMP-2的释放速率与插入的MMP-2linker肽的催化活性具有相似趋势。
从我们对靶蛋白B1、B2和B3的设计可知，嵌入的BMP-2生长因子需要MMP-2linker的裂解才能获得释放。我们建立了由巨噬细胞作为MMP-2酶来源的MMP-2酶触发的体外释放系统。我们优先使用可溶性水溶液来验证分别含有PAGLWA、PLGLWA和VLGLWA的linker在MMP-2酶作用后的裂解以BMP-2蛋白的释放情况。巨噬细胞条件培养基作为MMP-2酶来源，将其与丝素溶液混合以发生反应。反应结束后，将反应后各组分用12%聚丙烯酰胺凝胶分离并回收。通过Westernblotting以BMP-2抗体验证各组分蛋白的分子量变化，结果表明在酶反应之后，外源蛋白对应条带分子量与反应前相比降低。该实验结果证实活性MMP-2酶能够识别并裂解linker，而BMP-2蛋白也在linker断裂后从剩余的丝素序列中分离出来。而在无细胞培养基中，BMP-2融合蛋白的分子量并没有下降，这说明活性MMP-2酶的存在是触发BMP-2生长因子释放的必要条件。
巨噬细胞介导的释放被用来验证MMP敏感位点催化活性的变化是否会影响hBMP-2的释放动力学。将具有相同BMP-2含量的SF-B1、SF-B2和SF-B3丝素切片，在M1巨噬细胞存在下进行释放分析。利用ELISA试剂盒测定各时间点采集的释放介质中BMP-2的含量，Westernblotting测定残留不溶性纤维中的BMP-2含量。结果表明在含有巨噬细胞的培养基中共培养4周后，3个不同处理组释放BMP-2蛋白的动力学差异显著，其中SF-B1组释放BMP-2的速度最快(52.92%)，其次是SF-B2组(32.24%)和SF-B1组(11.74%)，说明药物(BMP-2蛋白)的释放动力学与催化活性(MMP酶)具有相似的趋势。催化活性的降低与BMP-2释放量减少有关，而随着动力学活性的增加，BMP-2的释放速率也随之增加。而与只相对的是，即使经过长时间的共培养，在未添加细胞的培养基中的样品均没有检测到BMP-2蛋白的释放。我们成功地获得了可在MMP-2酶存在条件下释放骨生长因子的新型蚕丝材料。通过DNA定量分析评价释放的BMP-2对间充质干细胞(MSC)增殖的影响。1周后，体外实验结果显示，WT茧片共培养MSC中的DNA含量增加，明显低于TSL-B1、TSL-B2或TSL-B3共培养MSC中的DNA含量，暗示转基因茧片中释放的BMP-2蛋白显示出促进骨再生过程第一步的骨祖细胞增殖的活性。
综上所述，我们创造了一种在骨骼再生过程中响应MMP-2酶生物刺激的新型丝素材料。与传统方法相比，该新型丝素材料不但能够在巨噬细胞分泌的基质金属蛋白酶作用下发生降解，而且可以持续释放BMP-2生长因子，同时也为控制蚕丝scaffolds在骨再生工程中的降解提供了一种新的策略。
虽然通过直接添食、化学改性、中尺度组装和大尺度混合等改性方法，能够实现赋予蚕丝材料新的所需功能，但是这些策略需要每次使用时对材料进行复杂的改性实验而且很难保证获得的每批材料的改性一致性。家蚕种系转化(germline transformation)作为一种可赋予丝素新功能的策略而受到了广泛的关注。家蚕种系转化方法通过将外源基因插入家蚕基因组可获得能吐出具有新功能蚕丝的转基因家蚕个体，而且这种经外源基因插入而获得的特性可以在转基因家蚕个体稳定维持并遗传给后代。因此，通过转基因家蚕特异在丝腺表达功能蛋白能够赋予蚕丝新功能并能稳定遗传给后代，这个方法有望能有效克服其他改性方法的缺点。
最近，人们特别重视智能药物传递系统，该系统响应组织环境信号并根据细胞需求释放生长因子，即所谓的“随需释放”。随需释放可以通过在传递系统中引入刺激响应组件来设计。最常用的触发机制涉及利用酶来裂解固定生长因子的连接物(linker)，从而导致封装生长因子的释放。基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinases-2, MMP-2)是在骨形成或再生过程中广泛存在的一种重要酶。如果在BMP-2两端添加MMP-2可酶解的linkers，在骨再生微环境中广泛存在的MMP-2酶作用下，有望实现在骨组织工程中BMP-2控制释放或随需释放以及控制蚕丝支架的降解速率。
基于以上考虑，本研究拟联合家蚕转基因技术、丝腺高效表达系统和上面提及的药物“随需释放”策略创制新的能用于骨组织工程的功能蚕丝材料。因此，研究中我们首先设计了一个在家蚕后部丝腺特异表达的融合结构，该融合结构表达获得的融合蛋白是将两端含有MMP-2linker的BMP-2分别与丝素重链N端和C端相连接；其次利用家蚕种系转化技术创制了基因组上含有上面设计的家蚕后部丝腺特异表达的融合结构的转基因家蚕品系；最后对获得家蚕转基因品系的家蚕吐出的新型蚕丝进行表征研究。研究结果表明通过我们的策略获得功能性蚕丝可以有效克服目前通过蚕丝改性而获得功能性蚕丝的缺点，同时也为控制蚕丝scaffolds在骨再生工程中的降解提供了一种新的策略。本研究获得的主要研究结果总结如下:
1.随需释放”BMP-2融合蛋白结构的设计及其家蚕丝腺表达系统载体的构建
首先根据家蚕基因组表达基因密码子偏好性对人骨形态发生蛋白BMP-2基因序列进行优化并商业合成hBMP-2；其次是根据文献报道选择了MMP-2酶解活性高(-PAGLWA-)、中(-PLGLWA-)、低(-VLGLWA-)三种不同的linkers作为BMP-2两侧的MMP-2酶解序列；最后是为了保证融合蛋白高量表达，选择了Fib-H的完整的N端和C端作为3种不同linker-hBMP-2-linker结构的两端。基于以上三点进一步完成了家蚕丝腺表达系统载体的设计和构建，具体如下：在hBMP-2基因的两端均成功连接了编码MMP-2linker的核苷酸序列，共获得产生3种不同linker-hBMP-2-linker的靶基因序列，分别命名为B1、B2和B3；家蚕丝腺表达系统载体的构建是基于本课组之前报道的丝素蛋白重链表达系统R3(Zhao et al， 2010)，分别用B1、B2、B3基因替换R3系统中的EGFP片段，成功构建了3个融合基因heavy-chain-B1、heavy-chain-B2和heavy-chain-B3。这3个融合基因包含2304-bp的Fib-HP3序列(含有重链5’上游序列、外显子1、内含子和外显子2的5’端序列)、1206-bp的B1、B2或B3序列以及333-bp的LBS序列(含有重链外显子2的3’端序列和poly-A序列)。随后将上述融合基因分别克隆至piggyBac转座载体中，得到pBac[3xP3-DsRed]-B1、pBac[3xP3-DsRed]-B2和pBac[3xP3-DsRed]-B3。DNA测序结果显示3个转基因载体构建正确。
2.转基因家蚕的创制与分析
利用胚胎显微注射的家蚕种系转化技术平台，将3个重组piggyBac转基因载体导入蚕卵，并利用带有DsRed滤光片的荧光体视显微镜筛选在眼睛中表达DsRed荧光的转基因后代个体。筛选结果显示，注射pBac[3xP3-DsRed]-B1、pBac[3xP3-DsRed]-B2和pBac[3xP3-DsRed]-B3的G1代蛾区中含有DsRed荧光表达的蛾区阳性率分别为13.4%、19%和6.3%。提取DsRed阳性蚕蛾的基因组DNA，经PCR分析结果证实了转基因在家蚕基因组中的整合。随后分别提取野生型和G1转基因蚕茧总蛋白，经SDS-PAGE和hBMP-2抗体免疫印迹法进行检测，结果在3种不同转基因蚕茧总蛋白中均分别检测到了单一的杂交信号，而野生型蚕茧总蛋白中没有检测到任何杂交信号条带，从而证实BMP-2在3种转基因蚕茧中均有表达。估算转基因蚕茧中表达的3种不同类型BMP-2蛋白B1、B2和B3的含量分别为7.2%、10.05%和5.87%。上述研究结果表明，heavy-chain-B1、heavy-chain-B2和heavy-chain-B3融合蛋白与丝素一起成功分泌至后部丝腺腔，并作为丝纤维的外源成分随丝蛋白一起分泌至蚕茧。
3.在丝素中加入可切割的MMPlinker也是一种具有前景的调控丝素降解的策略
将丝素加工成不同的形态已经在组织工程中得到了广泛的应用，因此评估这些过程对外源蛋白含量的影响具有重要意义。将经蚕茧脱胶处理后制成的天然丝素切片和利用丝素溶液经再生制备的水凝胶、膜和冻干粉等不同形态的材料用LISCN溶液再溶解并经Westernblotting分析，结果表明利用丝素溶液制作水凝胶、膜和冻干粉的再生过程中，材料中的hBMP-2含量与初始含量相比分别降低了40%、52%和60%；而天然丝素切片中BMP-2的剩余含量(80%)仍足以用于后续实验。因此，我们采用丝素切片进行后续实验。
我们将丝素切片植入家兔皮下，H&E染色结果显示植入后4周内出现细胞浸润现象，并判断观察到的细胞可能是炎症细胞。因此，我们使用明胶酶谱法检测了炎症细胞(包括单核细胞、未极化和极化的巨噬细胞M1)中MMP-2酶的存在和活性。结果表明，单核细胞和巨噬细胞分泌的MMP-2酶均呈时间依赖性。我们测定获得了表观分子量分别为62-kDa和72-kDa的2种条带，其中72-kDa条带为前体形式的MMP-2酶，62-kDa条带为活性形式的MMP-2酶。单核细胞THP1和未极化的巨噬细胞仅分泌前体MMP-2酶。巨噬细胞极化后第5天检测到少量的活性MMP-2酶，而第7天在巨噬细胞M1的条件培养基中检测到大量的活性MMP-2酶。调控骨愈合不同阶段的不同类型细胞主要包括巨噬细胞、成骨细胞和破骨细胞。特别值得注意的是，巨噬细胞已被证明是丝材料植入后的第一个应答者。我们的研究结果表明，巨噬细胞M1可以作为MMP-2酶的廉价来源和MMP介导降解研究的体外模型。
将无菌丝素切片分别置于不含或含有炎症性巨噬细胞M1的培养基中共培养4周。通过测量丝素切片的质量变化来监测丝素在培养基中的降解情况，并利用扫描电镜观察丝素切片的形态变化。将丝素切片与巨噬细胞M1共培养至M1开始分泌MMP-2后的前3天，各组丝素切片降解率无明显差异，推测可能原因是MMP-2酶仍处于前体状态。而将丝素切片与M1共培养7天后，培养基中MMP-2酶的数量和活性已经能够导致不同处理组丝素切片的降解速率发生差异。共培养28天后，与具有中等催化活性(B2，23.40%)和低催化活性(B3， 11.93%)的丝素切片相比，具有高催化活性的丝素切片质量损失较大(B1，38.07%)。而在无细胞培养基中，丝素切片的干重降低幅度极小甚至为0，从而证实了丝素切片的降解可能是由巨噬细胞分泌的MMP-2酶所介导。扫描电镜形态分析表明，MMP-2linker的加入在一定程度上促进了丝素重链的降解。野生型丝素切片仍保持原有结构，而转基因TSL-B1、TSL-B2、TSL-B3切片表面均出现颗粒碎片。
4.BMP-2的释放速率与插入的MMP-2linker肽的催化活性具有相似趋势。
从我们对靶蛋白B1、B2和B3的设计可知，嵌入的BMP-2生长因子需要MMP-2linker的裂解才能获得释放。我们建立了由巨噬细胞作为MMP-2酶来源的MMP-2酶触发的体外释放系统。我们优先使用可溶性水溶液来验证分别含有PAGLWA、PLGLWA和VLGLWA的linker在MMP-2酶作用后的裂解以BMP-2蛋白的释放情况。巨噬细胞条件培养基作为MMP-2酶来源，将其与丝素溶液混合以发生反应。反应结束后，将反应后各组分用12%聚丙烯酰胺凝胶分离并回收。通过Westernblotting以BMP-2抗体验证各组分蛋白的分子量变化，结果表明在酶反应之后，外源蛋白对应条带分子量与反应前相比降低。该实验结果证实活性MMP-2酶能够识别并裂解linker，而BMP-2蛋白也在linker断裂后从剩余的丝素序列中分离出来。而在无细胞培养基中，BMP-2融合蛋白的分子量并没有下降，这说明活性MMP-2酶的存在是触发BMP-2生长因子释放的必要条件。
巨噬细胞介导的释放被用来验证MMP敏感位点催化活性的变化是否会影响hBMP-2的释放动力学。将具有相同BMP-2含量的SF-B1、SF-B2和SF-B3丝素切片，在M1巨噬细胞存在下进行释放分析。利用ELISA试剂盒测定各时间点采集的释放介质中BMP-2的含量，Westernblotting测定残留不溶性纤维中的BMP-2含量。结果表明在含有巨噬细胞的培养基中共培养4周后，3个不同处理组释放BMP-2蛋白的动力学差异显著，其中SF-B1组释放BMP-2的速度最快(52.92%)，其次是SF-B2组(32.24%)和SF-B1组(11.74%)，说明药物(BMP-2蛋白)的释放动力学与催化活性(MMP酶)具有相似的趋势。催化活性的降低与BMP-2释放量减少有关，而随着动力学活性的增加，BMP-2的释放速率也随之增加。而与只相对的是，即使经过长时间的共培养，在未添加细胞的培养基中的样品均没有检测到BMP-2蛋白的释放。我们成功地获得了可在MMP-2酶存在条件下释放骨生长因子的新型蚕丝材料。通过DNA定量分析评价释放的BMP-2对间充质干细胞(MSC)增殖的影响。1周后，体外实验结果显示，WT茧片共培养MSC中的DNA含量增加，明显低于TSL-B1、TSL-B2或TSL-B3共培养MSC中的DNA含量，暗示转基因茧片中释放的BMP-2蛋白显示出促进骨再生过程第一步的骨祖细胞增殖的活性。
综上所述，我们创造了一种在骨骼再生过程中响应MMP-2酶生物刺激的新型丝素材料。与传统方法相比，该新型丝素材料不但能够在巨噬细胞分泌的基质金属蛋白酶作用下发生降解，而且可以持续释放BMP-2生长因子，同时也为控制蚕丝scaffolds在骨再生工程中的降解提供了一种新的策略。