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猪革拉斯氏病(Glasser’s disease)是由副猪嗜血杆菌(HPS)引起的以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎为主要临床特征的一种高致病率和致死率的细菌性传染病。抗生素和疫苗接种是防控该病的常用方法。由于各类抗生素的不合理使用,导致HPS耐药性的产生且日趋严重,因此疫苗接种则成为预防Glasser’s disease和降低死亡率的有效措施。然而,HPS有15种以上的血清型,不同血清型HPS之间缺乏交互免疫力,且具有明显的地方性特征,造成疫苗免疫效果的不确定性。此外,当前生猪生产中疫病种类较多,疫苗接种频繁,导致许多猪场并非采用此种方式以防控HPS感染。所以及时监测和分析是了解疫苗免疫效果及猪群中HPS感染情况的重要手段。转铁结合蛋白(Tbp)是HPS的主要毒力因子之一,包括Tbp A和Tbp B两种多肽结构。本实验室前期研究结果显示Tbp A具有良好的免疫原性和反应原性,可对同源菌以及不同血清型菌株的攻毒提供良好的免疫保护力。本研究系利用HPS重组Tbp A作为包被抗原建立间接ELISA抗体检测方法,旨为猪群免疫监测及Glasser’s disease的血清流行病学调查提供一种快速、敏感且特异的技术手段。本研究内容:(1)对HPS血清型4型和13型分别进行重组Tbp A的表达纯化与鉴定,并将其作为包被抗原,建立检测HPS抗体的间接ELISA方法(代号分别为4型Tbp A-ELISA和13型Tbp A-ELISA)。(2)对两种方法的抗原浓度及包被条件、封闭液种类及封闭时间、血清和酶标二抗的稀释度及作用时间、显色时间等反应条件进行优化。(3)利用优化的方法分别检测30份HPS阴性血清,确定两种方法的临界值。(4)利用优化的方法分别对猪链球菌(SS)、猪大肠杆菌(E.coli)、猪丹毒杆菌(ER)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪圆环病毒2型(PCV 2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)阳性血清进行检测,评估两种方法的特异性。(5)将HPS标准阳性血清按1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400进行倍比稀释,利用优化的方法分别与商品化检测HPS抗体的ELISA试剂盒同时进行检测,评估两种方法的敏感性。(6)分别用同一批次和三个不同批次表达纯化的HPS重组Tbp A进行包被,利用优化的方法分别对4份HPS阳性血清和1份HPS阴性血清样品进行批内及批间试验,计算变异系数,评估两种方法的重复性。(7)应用优化的两种方法分别对安徽某规模化猪场60份经HPS疫苗接种的猪血清样品进行免疫抗体检测,并与分别以HPS血清型4型和13型全菌体为包被抗原的间接ELISA抗体检测方法、商品化检测HPS抗体ELISA试剂盒以及Western-blot作平行比较,考察两种方法的可靠性。(8)利用筛选出的方法对源自安徽10个地市10个规模化猪场总计600份未经HPS疫苗接种的猪血清样品进行感染抗体检测,验证该方法的应用性。结果显示:(1)经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,HPS两种血清型的重组Tbp A均成功获得表达和纯化。(2)4型Tbp A-ELISA和13型Tbp A-ELISA的优化反应条件是:最适抗原浓度分别是5μg/m L、7μg/m L,均为4℃过夜包被;均采用5%脱脂奶粉于37℃封闭2 h;最佳血清稀释度分别是1:1600、1:3200,孵育时间分别为37℃45min、37℃60 min;最佳酶标二抗稀释度分别是1:5000、1:10000,作用时间分别为37℃30 min、37℃60 min;显色时间分别为37℃5 min、37℃10 min。(3)优化的两种方法阳性临界值分别为0.215和0.292,阴性临界值分别为0.188和0.242。(4)优化的两种方法均不与SS、E.coli、ER、APP、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV阳性血清产生交叉反应,特异性强。(5)优化的4型Tbp A-ELISA敏感性与商品化检测HPS抗体ELISA试剂盒相同,而13型Tbp A-ELISA敏感性则略低于试剂盒。(6)优化的两种方法批内及批间试验变异系数均小于10%,重复性良好。(7)4型Tbp A-ELISA检测HPS免疫抗体阳性率为80%,与平行比较方法的总符合率分别为90%、88.33%、86.67%和90%,一致性较高;13型Tbp A-ELISA检测HPS免疫抗体阳性率为76.67%,与平行比较方法的总符合率分别为80%、90%、83.33%、86.67%。(8)600份血清样品共检出阳性样品117份,HPS感染抗体总阳性率为19.5%。结果表明:(1)本研究分别以HPS血清型4型和13型的重组Tbp A作抗原,成功建立了特异性强、敏感性高、重复性好的检测HPS抗体的间接ELISA方法(代号分别为4型Tbp A-ELISA和13型Tbp A-ELISA)。(2)应用两种方法对进行和未进行HPS疫苗免疫的猪血清样品进行检测,确证4型Tbp A-ELISA更适于临床HPS抗体检测和流行病学调查。