丹参为唇形科(Labiatae)鼠尾草属(Salvia)植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)的根及根茎,此外,在实际应用中还存在一些地方代用品与混淆品,如甘西鼠尾(Salvia przewalskii Maxim),荫生鼠尾(Salvia umbratica Hance),雪见草(Salvia plebeia R. Br)及多种同属植物。近年来,主产地栽培丹参逐步成为药材的主要来源,但是,种子市场基源品种混乱,而且同名异物、同物异名现象严重。几种鼠尾草属植物的种子在外部形态上非常相近,难以凭感官宏观鉴别。为确保丹参药材质量的稳定、可控,在规模化、规范化种植中首先要保证丹参种源纯化、优良。本实验从外观性状、显微特征、理化性质等方面,并利用细胞生物学、分子生物学技术及超微技术对鼠尾草属几种植物的种子进行综合鉴别研究。既有快速、简便、实用、满足基层需要的方法又有新技术与传统中药鉴定技术交叉融合的深层次鉴别研究,也是我省制定中药种子标准前重要的应用基础研究。第一部分性状、显微、理化鉴别目的:应用快速、简便、实用的方法,建立丹参、甘西鼠尾、荫生鼠尾、雪见草种子的外观性状、显微特征、超微特征、理化性质方面的综合鉴别信息指征。方法:1外观性状观察。2种皮脱色表面片制备:(1)脱色:取种皮切成12 mm小块浸入水合氯醛(1:1)溶液中。(2)压片观察。3石蜡横切片制备:(1)取材和固定:种子F.A.A固定液固定一周以上。(2)脱水:依次用浓度为70 %、80 %、90 %、95 %的乙醇溶液、无水乙醇进行脱水,每隔2~3 h调换溶液。(3)透明:二甲苯:无水乙醇(1:1)浸种1~2 h后,转入二甲苯中至种子透明为止。(4)浸蜡:65℃恒温箱中进行,半小时调蜡一次,至种子完全浸透。(5)包埋和切片:石蜡包埋,切片厚度12μm。(6)贴片和融蜡。(7)染色:番红-固绿双重染色。(8)脱水与封藏。4种皮扫描电镜观察:(1)清洗:取种子用50 %乙醇超声清洗5 min。(2)脱水:50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %乙醇逐级脱水,每一级脱水两次,每次30 min,其间不断震荡清洗。(3)固定:戊二醛固定30 min。(4)电镜观察:真空喷金后,进行观察。5紫外扫描图谱特征:(1)取过40目筛的种子粗粉各1.0 g用石油醚索氏提取3 h,制备供试液A;挥干石油醚用乙酸乙酯索氏提取3 h,然后挥干乙酸乙酯用甲醇索氏提取3 h,制备供试液B。(2)扫描波长为200~400 nm的紫外吸收图谱。(3)图谱分析。6薄层色谱鉴别:(1)取一定量种子粉末用石油醚索氏提取3 h制备供试液C,挥干石油醚用乙酸乙酯索氏提取3 h,制备供试液D,供点样;(2)点样,展开。(3)显色、观察、照相。7高效液相鉴别:提取:甲醇索氏提取样品中的成分;色谱条件:选用合适的色谱柱,调整流动相的组成、配比、pH、检测波长及流速,使样品中所含成分色谱峰的分离度符合测定要求。结果:1宏观性状:四种种子均为纺锤状,丹参、甘西鼠尾、荫生鼠尾种子稍大,雪见草种子稍小,整体性状相似不易区分。2种皮脱色表面片:四种种子内外表皮细胞的垂周壁形状、增厚程度和后含物方面有一定的区别。3石蜡横切片:四种种子的表面凸起,角质层次级凸起特征、细胞层数和形状上都有明显差别。4扫描电镜观察:四种种子的种脐特征、种脐周围及侧面种皮纹饰区别明显。5紫外扫描图谱:乙酸乙酯和甲醇提取部分的吸收峰数目和吸收峰位置具有差别。6薄层色谱:几种供试液丹参、甘西鼠尾、荫生鼠尾、雪见草种子的薄层色谱具有差别,可用于鉴别。7高效液相色谱:四种种子的色谱峰既有共有峰,又有特征峰,能有效的鉴别。结论:丹参、甘西鼠尾、荫生鼠尾和雪见草的种子在外观性状、显微特征、理化性质存在差异,可用于鉴别。方法快速、简便、实用。第二部分细胞生物学及分子生物学特征研究目的:利用染色体组型分析及种子蛋白质PAGE和SDS-PAGE技术研究药用丹参品种之间及鼠尾草属几种植物种子的综合鉴别信息指征,从细胞水平及分子水平鉴别真伪,并为丹参的品种筛选提供依据。方法:1根尖体细胞染色体标本片制备:(1)预处理:种子25℃下萌发,根尖长0.5~1.0 cm时切取,蒸馏水4℃处理24 h。(2)固定:卡诺固定液(无水乙醇:冰醋酸3:1)固定1.0~1.5 h。(3)解离:95%乙醇:浓盐酸(1:1)解离10~15 min。(4)后低渗:重蒸水低渗,时间8~15 min。(5)染色:改良石炭酸品红液染色。(6)封片:冰冻揭盖片,中性树胶封片。(7)显微照相、计数、测量。2聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱特征研究:(1)制备供试品溶液。(2)制备分离胶和浓缩胶。(3)电泳:恒定电压120~180 V。(4)染色和洗脱:考马斯亮蓝(R-250)染色,脱色液洗脱至背景清晰为止。(5)结果分析:绘图并测定特征谱带泳动率。3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱特征研究:(1)制备供试品溶液。(2)制备分离胶和浓缩胶。(3)电泳:恒定电压80~120 V。(4)染色和洗脱:考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液染色,脱色液洗脱至背景清晰为止。(5)结果分析:绘图并测定蛋白分子量。结果:1根尖体细胞染色体组型特征:丹参染色体总数目为2n=16,染色体总长度26.25μm,平均长度1.64μm,变异倍数为1.72,臂比值变化范围为1.11~1.74;甘西鼠尾染色体总数目为2n=32,染色体总长度42.88μm,平均长度1.34μm,变异倍数为1.60,臂比值变化范围为1.06~1.82。荫生鼠尾染色体总数目为2n=16,染色体总长度24.94μm,平均长度1.56μm,变异倍数为2.03,臂比值变化范围为1.00~2.10;雪见草染色体总数目为2n=16,染色体总长度14.34μm,平均长度0.90μm,变异倍数为1.69,臂比值变化范围为1.00~2.09。2聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱特征:丹参、甘西鼠尾、荫生鼠尾、雪见草种子的谱带数目和位置不同。丹参图谱中一级带2条,二级带2条;甘西鼠尾图谱中一级带2条,二级带1条,三级带1条;荫生鼠尾图谱中一级带2条,二级带3条,三级带2条;雪见草图谱中一级带1条,二级带2条,三级带1条。鼠尾草属几种植物种子之间有明显差别。3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱特征:丹参、甘西鼠尾、荫生鼠尾、雪见草种子的蛋白分子量不同。丹参图谱中蛋白分子量为24.8、30.4、37.3、71.0、89.7、143.2 KD;甘西鼠尾图谱中蛋白分子量为20.2、22.7、24.8、30.4、37.3、71.0、89.7、143.2 KD;荫生鼠尾图谱中蛋白分子量为20.2、22.7、24.8、27.9、30.4、37.3、71.0、89.7、143.2 KD;雪见草图谱中蛋白分子量为24.8、29.6、34.2、37.3、54.6、79.8、89.7、143.2 KD。鼠尾草属几种植物种子之间有明显差别。结论:应用分子生物学技术进行种子鉴别研究,消除了种子性状特征易受外界环境影响的特点,可以较根本的揭示丹参及其混淆品之间的差异。不但为丹参种源筛选提供依据,也为鼠草属的物种研究提供了一定的方法。