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脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发性脑肿瘤。脑胶质瘤恶性程度高、易复发,且生存期短。因此,有待深入探讨脑胶质瘤的病理机制并寻找新的治疗策略。肿瘤微环境中,T细胞介导的细胞免疫是机体抗肿瘤的主要效应机制。PD-1/PD-L1途径负性调控机体的抗肿瘤免疫应答,不仅参与肿瘤的恶性生物学行为,也是肿瘤免疫干预的重要靶点。本研究检测了脑胶质瘤组织中PD-L1分子的表达,并分析PD-L1分子的表达与脑胶质瘤病理分级的相关性;采用激发型CD3单抗联合CD28单抗活化的外周血单个核细胞(PBMCs)中的T细胞和诱导其表达PD-1分子,选择高表达PD-L1分子的脑胶质瘤细胞株U251为细胞模型,探讨脑胶质瘤细胞表达的PD-L1分子对活化PBMCs增殖、凋亡和分泌细胞因子IFN-γ和IL-2的影响,为靶向PD-1/PD-L1途径干预脑胶质瘤的策略提供实验依据。第一部分PD-L1分子在脑胶质瘤组织的表达及临床意义[目的]检测PD-L1分子在脑胶质瘤组织的表达并分析其临床意义。[方法]选取包含57例脑胶质瘤患者的肿瘤组织和3例正常人脑组织的组织芯片,采用免疫组织化学染色技术检测PD-L1分子在脑胶质瘤组织中的表达,分析PD-L1染色综合评分与脑胶质瘤病理分级的相关性。[结果]正常人脑白质未检测到PD-L1分子的表达,56例脑胶质瘤患者的肿瘤组织(剔除组织损坏的样品1例)均表达PD-L1,PD-L1染色综合评分为5.11±2.36,明显高于正常脑组织(0.00±0.00),有统计学意义(P<0.01);WHO病理分级Ⅲ/Ⅳ级脑胶质瘤组织PD-L1染色综合评分为5.55±2.44,明显高于WHO病理分级Ⅰ/Ⅱ级脑胶质瘤组织PD-L1染色综合评分3.50±1.00(P<0.01)。[结论]PD-L1分子普遍表达于脑胶质瘤组织,且高表达于病理分级恶性度高的脑胶质瘤组织。PD-L1可能是脑胶质瘤的病理诊断的标记分子,靶向PD-1/PD-L1手段可能适用于针对脑胶质瘤的免疫干预。第二部分 脑胶质瘤细胞表达PD-L1对活化外周血单个核细胞增殖、凋亡和分泌细胞因子的影响[目的]观察胶质瘤细胞表达PD-L1分子对PBMCs中活化T细胞增殖、凋亡和产生细胞因子IFN-γ和IL-2的影响,探讨脑胶质瘤细胞表达PD-L1分子的免疫抑制作用。[方法]1.采用免疫荧光标记和流式细胞术检测脑胶质瘤细胞株U251细胞和U87细胞表面PD-L1分子的表达。2.采用激发型人CD3单抗联合激发型CD28单抗活化PBMCs中的T细胞,采用免疫荧光标记和流式细胞术检测PD-1分子的表达。3.将丝裂霉素(MMC)预处理的U251细胞与活化PBMCs按1:5混合,并加入PD-1/PD-L1阻断性单抗6E1共培养。48 h采用流式细胞术检测细胞内IFN-γ的表达水平;72 h以台盼蓝溶液染色后计数PBMCs数量变化,ELISA法检测IFN-γ和IL-2的含量;96 h采用Annexin V/PI凋亡试剂盒染色,通过流式细胞仪检测PBMCs细胞的凋亡情况。[结果]1.人脑胶质瘤细胞株U251细胞高水平表达PD-L1分子。2.未活化的PBMCs表面不能检测到PD-1分子的表达,经CD3单抗联合CD28单抗双信号活化后,可检测到PBMCs表面可检测到PD-L1的持续表达。3.U251细胞可明显抑制活化PBMCs细胞增殖、促进细胞凋亡;单抗6E1可部分逆转U251细胞对活化PBMCs细胞增殖的抑制和促进凋亡作用。4.U251细胞可明显抑制活化PBMCs细胞IFN-γ及IL-2的产生,而单抗6E1可明显逆转U251细胞对IFN-γ产生的抑制作用。[结论]脑胶质瘤细胞表达PD-L1分子发挥负性免疫调节作用。这提示了PD-1/PD-L1途径可能是脑胶质瘤病理过程中抑制抗肿瘤免疫应答的重要机制,也是脑胶质瘤生物治疗的重要靶点。