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背景与目的微小RNA(microRNA,miRNA)是一类约含20~23个碱基、内源性非编码小分子RNA。研究表明,miRNA可通过与其靶基因信使RNA(mRNA)的3′端非编码区(3′UTR)互补配对,降解靶基因mRNA或者抑制其翻译,从而负向调控靶基因的表达,参与调节细胞分化、增殖、周期和凋亡等生命进程。大量研究表明,miRNA的异常表达在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。肺癌位居全球居民癌症死因的首位,烟草暴露是其主要环境危险因素,约90%的肺癌发生与吸烟相关。吸烟过程可产生60多种致癌物质,其中苯并[a]芘(benzo(a)pyrene,B[a]P)是最主要的致癌物之一,是多环芳(香)烃(polycyclic aromatic hydrocarbon ,PAH)家族的典型代表。B[a]P体内代谢活化后其最主要的代谢终产物反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(anti-benzo(a)pyrene-7,8-diol-9,10-epoxide,anti-BPDE)具有强烈的致癌作用,但其致癌机制尚不完全明了。前期研究显示,在anti-BPDE诱导的恶性转化细胞中,存在多个肿瘤相关基因和miRNA异常表达的现象,其中,癌基因Ras基因家族(H-Ras、K-Ras、N-Ras)中的N-Ras基因在anti-BPDE诱导的恶性转化细胞中表达水平改变最大,其异常高表达在anti-BPDE诱导细胞恶性转化过程中发挥重要作用。本课题组前期对anti-BPDE诱导细胞癌变过程中部分高表达的miRNA做了初步研究,在其功能和化学致癌作用方面有了初步进展,但表达水平下调的miRNA尚缺乏研究。已有的研究表明,miRNA能通过靶向作用于癌基因或抑癌基因而调控肿瘤的发生发展,而高表达和低表达的miRNA生物学功能也极为不同。为深入研究异常低表达的miRNA在恶变支气管上皮细胞中的功能,经生物信息学预测,选则了可能以N-ras为靶基因的低表达miR-506和miR-542-3p作为研究对象探讨其功能。本研究拟利用anti-BPDE诱导的恶性转化细胞模型,通过瞬时转染处理模型细胞,上调miR-506和miR-542-3p成熟体表达水平,检测其对N-ras基因的调控作用和对恶变细胞生物学特性的影响,揭示miR-506和miR-542-3p在恶变的支气管上皮细胞中的功能。方法1.生物信息学预测利用TargetScan、miRanda、miRnet、RNA22和RNAhybrid等miRNA靶基因预测软件和网站,预测可能作用于N-Ras基因3’端非翻译区(3’UTR)的miRNA。2. miRNA模拟物瞬时转染利用脂质体Lipofectamine-2000将miRNA的模拟物导入16HBE-T细胞,转染步骤按说明书进行。转染5.5h后荧光显微镜下观察带有荧光标记的miRNA非特异序列模拟物阴性对照组的转染效率。3. miRNA和N-Ras表达水平的检测用TaqMan探针法和SYBR Green染料法分别对miRNA和N-Ras mRNA进行qRT-PCR定量检测。利用Western blot检测N-Ras基因在蛋白水平的表达改变。4.细胞活力实验以3×103个/孔的细胞密度接种96孔板,隔天分组进行处理。转染24h和48h后分别用CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖能力。检测步骤按试剂盒说明书执行。5.细胞周期实验细胞接种后无血清培养24h使细胞周期同步化,然后转染miRNA模拟物,48h后收集细胞进行检测,用PI染色,流式细胞仪检测细胞周期。6.凋亡实验转染处理48h后,用0.25%不含EDTA的胰酶消化液收获细胞,用Annexin V-FITC试剂盒和流式细胞仪检测细胞凋亡率。7.细胞划痕实验细胞转染24h后,接种到6孔板。待其长至完全汇合,用吸头在平板上进行划线。冲洗干净脱落的细胞,37℃无血清培养24 h后,显微镜下拍照。8.软琼脂实验每孔加2 ml 0.35%低熔点琼脂糖细胞混合液(1000个cell/孔)于已铺好含2ml 0.6%底层琼脂的6孔板里,放置培养箱中培养2周后,计数大于50个细胞的克隆。9.裸鼠试验转染24 h后,胰酶消化收获细胞,用PBS洗涤后重悬,各组细胞悬液调整为统一密度,取150μl约含4×106个细胞的PBS细胞悬液注射于4周龄的BALB/c裸鼠腹股沟皮下。成瘤后每五天测量肿瘤体积,20天后处死,取出肿瘤称重。10.统计分析采用SPSS 11.5统计软件进行统计分析。数据以x±s表示,所有试验数据均至少3次重复。两组间比较用双侧Student’s t-test;3组以上的比较采用单因素方差分析,所有检验均以双侧P﹤0.05为差异有统计学意义。结果1.生物信息学分析经预测,miR-506和miR-542-3p在N-Ras 3’UTR各有1个结合位点。miRNA序列与靶基因结合位点序列在多物种间高度保守。2. miRNA和N-Ras的基础表达情况16HBE-T细胞中miR-506和miR-542-3p表达水平显著低于16HBE-N细胞(P<0.05),分别是16HBE-N的(0.35±0.03)倍和(0.39±0.07)倍,同时N-Ras的mRNA和蛋白在16HBE-T细胞中的表达水平显著高于16HBE-N细胞,分别是16HBE-N细胞的(3.56±0.50)倍和(1.62±0.13)倍(P<0.05)。3.转染miRNA模拟物后miRNA和N-Ras的表达变化转染处理48h后,miR-506-mimic组的miR-506和miR-542-3p-mimic组的miR-542-3p表达水平分别上调了(4.70±0.63)倍和(5.23±0.55)倍,与miR-nc组相比差别有统计学意义(P<0.05);miR-506-mimic组N-Ras mRNA和蛋白的表达水平分别下调为(0.45±0.08)倍和(0.57±0.10)倍,差别有统计学意义(P<0.05);miR-542-3p-mimic组N-Ras mRNA和蛋白的表达水平分别改变为(0.94±0.18)倍和(0.85±0.11)倍,差异无统计学意义。4.转染后细胞增殖能力改变转染48h后, miR-506-mimic组(73.42±6.35)%和miR-542-3p-mimic组(62.06±5.61)%的细胞活力显著下降,与miR-nc组相比差别具有统计学意义(P<0.05)。5.转染后细胞周期分布改变miR-506-mimic组和miR-542-3p-mimic组G0/G1期细胞比例明显增多、S期和G2/M期细胞比例明显减少,与miR-nc组相比差别具有统计学意义(P<0.05)。6.转染后细胞凋亡率改变转染处理24 h、48h后,miR-506-mimic组和miR-542-3p-mimic组的凋亡率与miR-nc组相比差别无统计学意义(P>0.05)。7.对细胞迁移能力的影响miR-506-mimic组和miR-542-3p-mimic组划痕的生长细胞覆盖区面积比分别下降为(0.48±0.10)和(0.31±0.08),与miR-nc组相比差异有统计学意义(P<0.05)。8.软琼脂实验miR-506-mimic组和miR-542-3p mimic组集落形成率降低,分别降低到(4.46±0.81)%和(5.87±0.67)%,与miR-nc组相比差别有统计学意义(P<0.05)。9.裸鼠实验miR-506-mimic组的肿瘤重量(694.00±124.39mg)和肿瘤体积(592.36±55.29mm3)均明显低于miR-nc组的重量(1152.50±131.24mg)和体积(969.82±62.31 mm3)(P<0.05)。结论1.在anti-BPDE诱导恶性转化的人支气管上皮细胞16HBE-T中miR-506和miR-542-3p成熟体低表达。2.miR-506和miR-542-3p成熟体表达水平改变会影响16HBE-T细胞的生物学特征。3.上调miR-506和miR-542-3p在anti-BPDE诱导恶变细胞中的表达水平能抑制细胞增殖,降低细胞恶性程度,miR-506和miR-542-3p具类抑癌基因作用。4.miR-506负向调控N-Ras基因表达。