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第一部分PRPS1基因变异功能验证及致病机制研究耳聋是临床上最常见的感觉神经系统缺陷疾病之一。据世界卫生组织（World Health Organization,WHO）统计,全世界超过5%的人口——4.66亿人患有不同程度的听力损失,约60%的听力损失因为基因缺陷导致。目前国际遗传性耳聋网站（hereditaryhearingloss.org）已收录遗传性非综合征型耳聋基因120个,常显耳聋基因48个,常隐耳聋基因76个,X连锁遗传耳聋基因5个。PRPS1基因位于Xq22.3,编码磷酸核糖焦磷酸合成酶I（PRS-1酶）,其催化5-磷酸核糖和ATP生成AMP和PRPP（5-磷酸核糖-1-焦磷酸）,PRPP是体内嘌呤、嘧啶和吡啶核苷酸从头合成和补救合成的重要底物。PRPS1突变引起酶活性的升高和降低可涉及包括耳聋在内的全身多器官多系统的病变。PRPS1突变体酶活性下降可导致DFNX1非综合征型耳聋,还可导致症状更为严重的CMTX5综合征（Charcot-Marie-Tooth Neuropathy X Type 5）和Art,s综合征。PRPS1突变体酶活性升高可导致轻度PRS超活性和重度PRS超活性。本研究鉴定了5例男性耳聋患者和1例正常对照携带PRPS1错义突变,对上述家庭成员进行了深入的问卷调查、听力学检查、体格检査等,收集CT、MRI等临床资料,采集血液样本,提取DNA进行PRPS1突变位点序列分析。通过采集患者、家庭成员及家系外正常对照的血液样本,提取血红蛋白后,进行体外PRS-1酶活性检测,为变异位点提供致病性证据。对PRPS1突变体进行致病性功能验证研究包括:1.以pEGFP-N1-Flag真核质粒为载体构建D65N、M115T、Q133P、G174R、N144S、I292V等18种突变型及野生型PRPS1真核表达质粒,选取各疾病代表性突变质粒通过转染HEK293FT细胞,提取蛋白进行Western Blot,实验结果显示不同疾病表型的PRPS1突变蛋白表达量无明显差异。2.将野生型及6种突变型PRPS1真核表达质粒（D65N、M115T、Q133P、G174R、N144S、I292V）转染至HEK293FT细胞进行免疫荧光定位研究发现不同疾病表型的PRPS1突变蛋白与野生型均集中表达在细胞质基质中,表达部位无明显差异。3.借助原核表达系统和高效液相色谱（HPLC）检测技术建立了高效可靠的高通量体外PRPS1酶活性检测平台,用于快速鉴定PRPS1变异功能影响及致病性判定。使用pET-28a His标签原核表达质粒构建PRPS1野生型及20种突变型质粒,在Rosetta宿主菌中进行蛋白表达,应用His标签Ni柱亲和层析进行PRS-1酶蛋白纯化,体外模拟PRS-1酶的反应环境,使用HPLC检测产物AMP的含量,从而明确不同疾病突变体PRS-1酶活性差异。结果显示PRPS1不同突变体引起的疾病表型越严重,PRS-1酶残余活性越低。应用该检测平台对本研究鉴定出的2个PRPS1新变异进行研究,结果显示Met73Val突变蛋白酶活性低于PRPS1野生型蛋白酶活性,明显高于CMTX5和Art,s综合征,残余酶活性为85.4%。Ile292Val突变蛋白与PRPS1野生型蛋白酶活性数值相近,残余酶活性为106.9%。PRPS1两个新变异酶活性符合疾病表型及判定结果,同样也认证了检测平台的可靠性。4.对纯化后的PRS-1酶蛋白进行等温滴定量热（Isothermal Titration Calorimetry,ITC）反应,使用ATP滴定PRS-1纯化蛋白,应用软件拟合两者的结合曲线,结果显示同野生型相比PRPS1突变蛋白（D65N、P276S、K280E）与ATP结合能力下降。综上所述,通过遗传分析和功能验证,本研究在中国耳聋人群和正常对照中鉴定了5个PRPS1致病性新突变位点和1个PRPS1良性位点,为5个耳聋家庭的临床耳聋基因诊断和遗传咨询提供了科学依据,为PRPS1基因突变数据库提供了6个新变异位点信息;开发了高通量体外PRPS1酶活性测定方法,为鉴定PRPS1变异位点致病性及阐明PRPS1致病机制提供了新的研究方法和高通量功能验证平台。第二部分耳聋家系遗传异质性研究本研究对一个四代遗传性耳聋家系进行了临床表型特征分析及致病基因鉴定。对HL-258家系成员进行问卷调查、听力学检查、视觉系统检查、体格检査等,发现该家系耳聋患者听力表型差异明显且存在两种遗传模式。应用靶向富集大规模平行测序（targeted genomic enrichment with massively parallel sequencing,TGE+MPS）和生物信息学分析对该家系进行致病基因鉴定,得到两个致病基因—POU4F3:NM002700.3:c.976A>G（p.Arg326Gly）和PDZD7:NM024895.4:c.490C>T（p.Arg164Trp）突变与该家系耳聋表型有关,Sanger测序验证两基因突变符合听力表型和基因型共分离,保守性分析显示两基因突变位点氨基酸残基在不同物种中高度保守,蛋白三维结构模拟分析提示两基因突变一定程度上干扰局部二级结构稳定性,影响蛋白亚细胞定位或局部疏水作用。本研究在一个耳聋家系中鉴定出POU4F3和PDZD7两个致病基因突变,两基因遗传模式不同,分别为常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传。该家系给予我们启示,在具有耳聋家族史的同一家系中有可能存在多个基因重叠致病情况,当我们发现一个基因的致病性突变时,耳聋基因诊断可能并没有结束,建议条件允许时,临床耳聋基因诊断应尽量选择高通量检测技术平台以避免漏诊。