论文部分内容阅读
目的：
体外表达异亮氨酸拉链(ILZ)修饰的hsGITRLaa52-177重组蛋白(ILZ—hsGITRL)，并初步鉴定ILZ—hsGITRL重组蛋白的结构特征和生物学活性。
方法：
(1)应用PCR技术，以hGITRL—TA质粒为模板，扩增获得hGITRLaa52-177基因，在其N端融合化学合成的异亮氨酸拉链基序(Isoleucinezipper，ILZ)，获得ILZ—hsGITRL重组基因，通过BamHI、HindⅢ双酶切PCR产物和原核表达质粒PET32a(+)，连接酶切产物，转化至感受态E．coliDH5α；选择阳性菌株，抽提重组质粒，进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切、PCR和基因测序鉴定。同时构建表达质粒PET32a(+)—hsGITRLaa52-177，与表达质粒PET32a(+)．ILZ—hsGITRLaa52-177，分别转化ROS表达工程菌，利用IPTG诱导蛋白表达。
(2)初次表达的重组蛋白为Trax—hsGITRL和Trax—ILZ—hsGITRL蛋白，分别通过SDS—PAGE和Westernblot进行鉴定。通过Ni+—IMAC柱分别对Trax—hsGITRL和Trax—ILZ—hsGITRL蛋白进行纯化。根据肠激酶的操作手册，对纯化的Trax—hsGITRL和Trax—ILZ—hsGITRL蛋白进行酶切，酶切后的蛋白分别再次通过Ni+—IMAC柱，Trax部分因含有His标签结合到Ni+—IMAC柱上，穿透峰蛋白即为纯化的hsGITRL或ILZ—hsGITRL蛋白。通过ELISA法分析纯化的hsGITRL和ILZ—hsGITRL蛋白与抗hGITRLmAb的结合特异性。
(3)利用Ficoll液密度梯度分离人外周血单个核细胞，通过免疫磁珠法分离CD4+T细胞，流式细胞术检测人CD4+T细胞的纯度。分别将纯化的hsGITRL和ILZ—hsGITRL蛋白按照一定的浓度加入人CD4+T细胞的培养体系，在抗人CD3mAb存在情况下，培养72小时，通过CCK-8法检测T细胞增殖情况。在相同的培养条件下，收集细胞培养上清，通过ELISA试剂盒检测IFN—γ的水平。分别将纯化的hsGITRL和ILZ—hsGITRL蛋白按照一定的浓度加入上述人CD4+T细胞的培养体系，在指定的不同的时间点收集培养细胞，通过Westernblot方法检测ERK1/2的磷酸化水平。
(4)通过凝胶过滤层析SephadexG-100柱和非还原性SDS—PAGE分析hsGITRL和ILZ—hsGITRL蛋白的结构特征，初步揭示其蛋白质性质。
结果：
(1)成功构建原核表达载体PET32a(+)—hsGITRLaa52-177和PET32a(+)—ILZ—hsGITRLaa52-177，经PCR和双酶切鉴定分别可见446bp和557bp的目的条带，测序结果显示hsGITRLaa52-177基因与GenBank中发表的序列(BC112032)完全一致。ILZ序列与化学合成的ILZ序列一致。
(2)将鉴定正确的表达载体导入ROS工程表达菌，以终浓度0.6mmol/LIPTG、25℃、诱导8h作为最佳蛋白诱导条件。利用超声裂解法裂解菌体，发现诱导表达的Trax—hsGITRL和Trax—ILZ—hsGITRL融合蛋白主要存在于胞质中。通过SDS—PAGE和Westernblot证实Trax—hsGITRL蛋白的相对分子量约为28KD，Trax—ILZ—hsGITRL蛋白的相对分子量约为32KD。经过Ni+—IMAC柱纯化的Trax—hsGITRL，以及Trax—ILZ—hsGITRL融合蛋白的纯度均＞90％。Trax—hsGITRL和Trax—ILZ—hsGITRL融合蛋白经过肠激酶酶切后，再次经过Ni+—IMAC柱纯化，收集到纯化的hsGITRL和ILZ—hsGITRL蛋白。SDS—PAGE和Westernblot证实hsGITRL蛋白的相对分子量约为14KD，ILZ—hsGITRL蛋白的相对分子量约为18KD。通过ELISA法证实纯化的hsGITRL和ILZ—hsGITRL蛋白能够与抗hGITRLmAb特异结合。
(3)免疫磁珠法分离获得人CD4+T细胞，纯度在＞92％左右。细胞增殖试验显示在亚浓度的抗CD3mAb存在下，hsGITRL和ILZ—hsGITRL蛋白在0.5～5μg/ml之间均能够有效地促进CD4+T细胞的增殖，并存在蛋白浓度依赖关系，而且ILZ—hsGITRL比hsGITRL蛋白的刺激作用更为显著。，通过ELISA法检测细胞培养上清中IFN—γ的含量，发现ILZ—hsGITRL比hsGITRL蛋白更有效地促进IFN—γ的分泌。通过细胞信号通路分析，证实hsGITRL和ILZ—hsGITRL蛋白均能有效地增强ERK1/2磷酸化水平，而且ILZ—hsGITRL促进ERK1/2磷酸化的能力更加明显。
(4)凝胶过滤层析和非还原性SDS—PAGE分析显示hsGITRL在溶液中主要以二聚体形式存在，单体和三聚体含量相对较少，而ILZ—hsGITRL蛋白在溶液中主要以三聚体含量存在，单体和二聚体含量相对较少。
结论：
(1)成功构建原核表达载体PET32a(+)—hsGITRLaa52-177和PET32a(+)—ILZ—hsGITRLaa52-177，并在ROS表达工程菌中表达目的蛋白。通过Ni+—IMAC柱两次纯化和肠激酶酶切，获得可溶性的hsGITRL和ILZ—hsGITRL目的蛋白。
(2)hsGITRL和ILZ—hsGITRL蛋白均能够与抗hGITRLmAb特异性结合。与hsGITRL蛋白相比，ILZ—hsGITRL蛋白明显促进ERK1/2磷酸化，从而增强人CD4+T细胞的增殖能力和IFN—γ的分泌。
(3)hsGITRL和ILZ—hsGITRL蛋白的生物学功能的差异可能与其各自的生物学结构有一定的关系。在溶液中，以三聚体为主要存在形式的ILZ—hsGITRL蛋白比以二聚体为主要存在形式的hsGITRL蛋白能够更好的发挥生物学功能。