鸡肉中PCBs免疫学检测方法研究

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多氯联苯(Polychlorinated biphenyls,PCBs),为具有209种同系物的苯环状家族类有机化合物。因其稳定的理化性质(耐热、电绝缘、抗氧化等),被广泛用于变压器、电容器、润滑油等。随着工业排放,广泛存在于土壤、空气和水体中。通过食物链累积富集进入人体,引发疾病。由于在环境中极为稳定,被列为持久性有机污染物(Persistent organic pollutants,POPs)。因此,开发并应用快速、精准、可广谱检测PCBs家族化合物的免疫学检测方法,作为仪器分析的有效补充,对保障食品安全尤为重要。在本研究中,根据PCBs核心结构,设计并合成了三种不同氯化结构半抗原,免疫小鼠获得广谱识别11种PCBs的单克隆抗体,基于该抗体材料,研发了胶体金免疫层析检测方法和聚集诱导发光固相免疫检测方法,结果如下:(1)半抗原合成与单克隆抗体制备:合成三种不同结构的半抗原PCBa,PCBb,PCBc,经质谱与核磁共振氢谱鉴定合成成功。利用活泼酯法将其分别与不同的载体蛋白BSA、KLH和OVA偶联,制备免疫原和包被原。通过免疫BAl B/c小鼠、细胞融合、亚克隆等步骤制备单克隆抗体。免疫结果表明,以PCB80为母体的羧酸衍生物半抗原PCBc能够诱导产生广谱识别PCBs的抗体。进而筛选获得单克隆杂交瘤细胞株C6-H8,其抗体亚型为Ig G1,可广谱识别11种PCBs其半数抑制浓度(IC50)范围为33.12-476.42 ng/m L。通过基因测序获得抗体可变区基因,利用分子模拟构建3D模型并对接。结果表明,该抗体与多氯联苯小分子之间的分子作用力主要为酪蛋白与小分子之间的苯环π-π键堆叠和卤键,揭示了对11种PCBs的识别机制。(2)胶体金免疫层析检测方法的建立:利用氯金酸还原法制备直径为20 nm的金纳米颗粒。标记已获得的单克隆抗体,建立以胶体金为探针的免疫层析方法(Lateral flow immunoassay,LFIA)。经优化p H、抗体量、包被原浓度以及探针量等条件,结果表明对PCB80,PCB169,PCB126,PCB189这4种多氯联苯裸眼检测Cut-off值(临界值)为2-5μg/m L,其余7种裸眼检测值均大于5μg/m L。(3)聚集诱导发光固相免疫检测方法的建立:以聚集诱导发光荧光微球(Aggregation-induced emission fluorescent microsphere,AIEFM)为信号标记物,分别建立了荧光试纸条与竞争型固相免疫检测方法,并对鸡肉中PCBs残留进行方法验证。荧光试纸条检测PCB80裸眼检测Cut-off值为1μg/m L。在最佳条件下,与ELISA方法相比,竞争型固相免疫检测方法对11种PCBs的IC50值提高到6.38-252.1 ng/m L,检测限(LOD)在0.32-42.15 ng/m L之间。方法验证结果表明,通过稀释消除基质干扰,可实现对加标鸡肉样品的精准检测,回收率为76.90%-91.64%,变异系数为8.5%-14.4%。此外,与GC-MS/MS仪器法对比,两种方法的检测结果一致,证明所建方法具有良好的准确性。以上研究为检测多氯联苯家族类化合物提供了一种简单、广谱和灵敏的检测工具,为快速、高通量筛查食品中的PCBs提供了可能。
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