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菠菜(Spinacia oleracea L.)是我国重要的经济型绿叶蔬菜之一,营养价值丰富,在全世界及我国范围内广泛种植。菠菜具有耐冷但不耐热的特性,高温胁迫严重影响菠菜的生长发育和产量,本文以耐热型菠菜Sp75和热敏感型菠菜Sp73为研究材料,利用分子生物学手段研究菠菜Spo PH1参与高温胁迫应答的分子机制,对提高菠菜产量及培育耐热菠菜新品种具有重要意义。PH结构域(Pleckstrin homology domain),由100-120个氨基酸组成的功能性区域,是一种存在于多种信号蛋白和细胞骨架相关蛋白中的功能性区域,参与细胞信号传递,细胞骨架的构成,膜转运等。研究Spo PH1对高温应答调控作用将为深入解析植物高温应答分子机制提供重要参考依据。1.对菠菜全基因组数据库的分析发现,在菠菜基因组中存在2个编码PH蛋白的基因。利用分子PCR技术,克隆到了Spo PH1基因,其最大开放阅读框为450bp,共编码150个氨基酸,理论分子质量为17.4k Da。2.利用同源序列比对分析发现,Spo PH蛋白与多种植物的PH蛋白同源性都较高,都含有一个较为保守的PH结构域,说明PH结构域在进化中较为保守。3.实时荧光定量RT-q PCR对Spo PH1进行表达模式分析。经37℃高温处理后,Spo PH1基因的表达在菠菜耐热材料Sp75叶片中随着处理时间的延长整体呈上升趋势,然而在菠菜热敏感材料Sp73叶片中整体为下降趋势,表明高温胁迫下Spo PH1基因在Sp75和Sp73中响应模式不同。在菠菜六叶期和抽薹期,分别检测不同器官中Spo PH1基因的表达。结果显示,在六叶期时,Spo PH1基因在侧根中的基因表达量最高,在主根中的基因表达量最低,在叶片中子叶的表达量要高于三对真叶。在抽薹期,Spo PH1基因在侧根中的表达量最高,在叶中的表达量最低。4.通过构建p BI121-Spo PH1-GFP植物表达载体,导入烟草(Nicotiana tabacum)叶片细胞中进行烟草瞬时表达分析,结果表明,Spo PH1蛋白定位于细胞质。5.通过构建p YES2-Spo PH1酵母表达载体,转入野生型酵母,获得Spo PH1转基因酵母,并进行高温表型分析。结果表明,在37℃高温处理条件下,与野生型酵母菌株相比与,Spo PH1转基因酵母更耐高温,这说明高温胁迫下Spo PH1基因在酵母细胞中起正调控作用。6.通过构建p ET32a-Spo PH1原核表达载体,诱导并纯化得到His-Spo PH1融合蛋白,通过蛋白免疫印迹法验证了蛋白质纯度,并利用磷脂酰肌醇体外结合实验,初步证实了Spo PH1蛋白具有结合磷脂酰肌醇的能力。7.通过构建p BI121-Spo PH1植物表达载体,并利用农杆菌侵染法获得了Spo PH1过表达拟南芥植株。利用农杆菌侵染法获得Spo PH1突变体回补株系。根系表型分析结果表明,与野生型拟南芥相比,Spo PH1过表达拟南芥的根长最长,At PH1拟南芥突变体的根长最短,Spo PH1纯合拟南芥突变体回补株系的根长较突变体的根长有一定的恢复,证明Spo PH1有可能影响拟南芥根长的生长。