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哮喘是一种常见的非传染性气道炎症疾病，气道高反应，气道重塑和气流受限为其主要特征。大部分病例发生在低收入国家或低中收入国家。根据世界卫生组织在2016年12月公布的，大约有235百万人患哮喘，在2015年有383000死亡病例，带来严重的经济负担和社会负担。哮喘发展的最危险因素是吸入的物质，例如花粉和尘螨，可能会引起过敏反应或者刺激气道。哮喘病人在临床上表现为反复发作的喘息，咳嗽，胸闷和气短，并且这些过程通常伴有肺部的气道阻塞，通过治疗或自行缓解。哮喘为异质性疾病，每个患者及不同的时间表现均不同。因此给哮喘发病机制的研究和治疗提出了很大的挑战。气道重塑是由于长期的慢性炎症导致，包括上皮脱落，上皮结构排列紊乱，上皮下胶原沉积，基底膜肥厚增生，粘液分泌增多，气道平滑肌增多，管腔狭窄。并且，针对哮喘的气道重塑治疗效果较差。因此，对哮喘气道重塑治疗的研究有重要的医疗价值。
针刺治疗哮喘，在我国由来已久。已经证实针刺能够改善肺功，降低哮喘患者气道高反应和气道炎症。针刺对于气道重塑的研究已经证实，针刺可以抑制豚鼠的气道平滑肌增厚。因此在此研究中，我们来探讨针刺改善气道重塑的机制。
一、哮喘动物模型建立及针刺疗效评价
目的：
1.建立哮喘动物模型
2.探究针刺对哮喘的气道高反应和气道炎症的调控作用
方法：
18只BALB/C小鼠根据随机数字表分为空白对照组，哮喘模型组和针刺治疗模型组，每组6只。哮喘模型组腹腔注射OVA和Al(OH)3致敏混悬液,最后使用OVA雾化激发。针刺模型组在致敏的基础上给小鼠针刺大椎，肺俞(双侧)和足三里(双侧)。观察小鼠的一般状态。使用小鼠RC系统检测小鼠的气道反应性，收集肺泡灌洗液进行离心，上清用于Elisa检测，沉渣用于淋巴细胞计数。小鼠肺组织进行HE病理检测。小鼠脾脏进行淋巴细胞分离并进行Th17和Treg细胞的流式检测。
结果：
哮喘模型组小鼠状态较差，在OVA致敏过程中有大小便失禁，深大腹式呼吸，喘息，呼吸困难等症状，其他两组改变不明显。
HE病理改变：空白对照组气道上皮排列整齐，无炎性细胞浸润，支气管腔内无腺体分泌。哮喘模型组小鼠的气道壁明显增厚，气道上皮排列紊乱，粘液分泌增加，大量炎性细胞浸润。针刺模型组与哮喘模型组相比则出现气道壁变薄，气道上皮排列趋于完整，粘液分泌减少。
气道反应性：哮喘模型组与空白对照组相比，乙酰甲胆碱浓度在(3.125mg/ml～50mg/ml)时气道阻力改变百分比升高，并且差异有统计学意义(P＜0.01)。针刺治疗模型组与哮喘模型组相比，乙酰甲胆碱浓度在(3.125mg/ml～50mg/ml)时气道阻力改变百分比降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。
肺泡灌洗液中的白细胞总数，哮喘模型组与空白对照组相比明显升高，针刺治疗模型组比哮喘模型组减少(P＜0.01)。细胞分类计数，与空白对照组相比，哮喘模型组的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞百分比明显升高，巨噬细胞百分比降低(均为P＜0.01)。针刺治疗模型组与哮喘模型组相比，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞百分比明显降低，巨噬细胞百分比升高(均为P＜0.01)。
Th17和Treg细胞流式结果：与空白对照组相比，哮喘模型组Th17细胞比例升高，Treg细胞比例降低(均为P＜0.01)。针刺治疗模型组与哮喘模型组相比，Th17细胞比例降低(P＜0.05)，Treg细胞比例升高(P＜0.01)。
肺泡灌洗液中细胞因子检测：与空白对照组相比，哮喘模型组TGF-β1，Notch1，IL-5和TNF-α均升高(P＜0.01)，针刺治疗模型组与哮喘模型组相比，均降低(P＜0.01)。
结论：
针刺能够降低哮喘气道高反应和气道炎症，并且能够调节Treg/Th7平衡。针刺能够治疗哮喘。
目的：
探讨针刺对哮喘气道重塑的影响及其机制
方法：
18只BALB/C小鼠根据随机数字表分为空白对照组，哮喘模型组和针刺治疗模型组，每组6只。哮喘模型组腹腔注射OVA和Al(OH)3致敏混悬液,最后使用OVA雾化激发。针刺模型组在致敏的基础上给小鼠针刺大椎，肺俞(双侧)和足三里(双侧)。采用Masson染色对小鼠的肺组织进行染色。采用免疫印迹试验检测三组的肺组织的E-cadherin、α-SMA、Notch通路和TGF-β通路蛋白。采用免疫组化法检测小鼠肺组织的E-cadherin蛋白和α-SMA蛋白。使用RT-PCR检测TGF-β通路与Notch通路mRNA。
结果：
Masson染色结果显示，哮喘模型组，小鼠气管壁下存在大量的胶原纤维沉积，呈现蓝色，而空白对照组则没有胶原纤维沉积，针刺组小鼠气管壁下的胶原沉积与哮喘模型组相比，则胶原沉积明显减少。
E-cadherin蛋白的表达：哮喘模型组比正常对照组相比，E-cadherin表达量降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比，E-cadherin表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。α-SMA蛋白的表达：哮喘模型组比正常对照组相比，α-SMA表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比，α-SMA表达量降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。
免疫组化的结果，从图中可以看出，E-cadherin表达量，CON组气道上皮阳性表达较密集，棕黄色颜色深；与CON组比较，ARH组颜色变浅，表达量下降(P＜0.01)；与ARH组比较，ACU组颜色变深，表达量升高(P＜0.01)。α-SMA蛋白表达量，CON组上皮下阳性表达少，与CON组比较，ARH组上皮下棕黄色颜色深，气道上皮下出现了明显增多的平滑肌以及肌成纤维细胞，蛋白表达量升高(P＜0.01)；与ARH组比较，ACU组上皮下阳性表达减少，表达量降低(P＜0.01)。
TGF-β通路蛋白的表达：哮喘模型组比正常对照组相比，表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比，表达量降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。Notch通路蛋白的表达：哮喘模型组比正常对照组相比，表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比，表达量降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。
针刺对TGF-β通路与Notch通路mRNA的影响：TGF-β1，Notch1和Hes-1的mRNA水平，哮喘模型组比正常对照组相比，表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比，表达量降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
TGF-β蛋白和Notch1蛋白表达量呈正相关(R=0.856,P＜0.01)；TGF-β蛋白和α-SMA蛋白表达量呈正相关(R=0.755,P＜0.01)；Notch1蛋白和α-SMA蛋白表达量呈正相关(R=0.936,P＜0.01)。
结论：
针刺大椎、肺俞和足三里可以降低气道高反应，针刺能够下调哮喘模型中的TGF-β通路与Notch通路。
三、探讨针刺对Atg5条件性基因敲除小鼠哮喘模型气道重塑的调控及其机制
目的：
探讨针刺对Atg5条件性基因敲除小鼠哮喘模型的气道重塑的调控及其机制
方法：
18只Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠为基因敲除小鼠阴性对照组根据随机数字表分为3组,CON(Cre-)组(空白对照组)、ARH(Cre-)组(哮喘模型组)，ACU(Cre-)组(针刺治疗组)每组6只。18只ATG5flox/floxCD4+Cre+基因敲除小鼠根据随机数字表分为3组，CON(Cre+)组(Atg5条件性基因敲除鼠空白对照组)、ARH(Cre+)组(Atg5条件性基因敲除鼠哮喘模型组)；ACU(Cre+)组(Atg5条件性基因敲除鼠针刺治疗组)。哮喘模型组腹腔注射OVA和Al(OH)3致敏混悬液,最后使用OVA雾化激发。针刺模型组在致敏的基础上给小鼠针刺大椎，肺俞(双侧)和足三里(双侧)。使用小鼠RC系统检测小鼠的气道反应性。小鼠肺组织进行HE病理检测。采用Masson染色对小鼠的肺组织进行染色。使用Elisa检测肺泡灌洗液中细胞因子。采用WB方法检测小鼠肺组织的E-cadherin、α-SMA和TGF-β通路蛋白。采用免疫组化法检测小鼠肺组织的E-cadherin蛋白和α-SMA蛋白。使用RT-PCR检测TGF-β1mRNA。
结果：
HE病理改变。Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠的肺组织病理改变：CON(Cre-)组小鼠气道上皮细胞排列整齐，气道壁厚薄均匀，周围无炎性细胞浸润。ARH(Cre-)组小鼠的肺组织病理图片显示气道壁明显增厚，气道平滑肌增生，气道上皮排列紊乱，脱落，杯状细胞化生，粘液分泌增加，大量炎性细胞浸润，在气管，血管，肺泡内，均可见到粘液分泌增加，气管管腔变窄。ACU(Cre-)组与哮喘模型组相比则出现气道壁变薄，气道平滑肌增生减弱，气道上皮趋于完整，粘液分泌减少，炎性细胞浸润明显减少，肺泡内分泌物也明显减少。Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠的肺组织病理改变：CON(Cre+)组小鼠气道平滑肌规则，支气管腔内无腺体分泌,肺组织无炎性细胞浸润。ARH(Cre+)组小鼠的肺组织病理图片显示气道壁轻微增厚，气道平滑肌可见增生，有一定数量的炎性细胞浸润，气管管腔内可见分泌物，但是比Atg5flox/floxCD4+Cre-组小鼠的ARH(Cre-)组破坏程度要轻。ACU(Cre+)组未见明显的杯状细胞化生，炎性细胞浸润明显减少，气道上皮排列趋于完整，病理学改变较ACU(Cre-)组改善明显。
气道反应性：Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠在Mch3.125～50mg/ml时，ARH组气道阻力增加百分比均明显高于CON组(P＜0.01)；经针刺治疗后，Cre-小鼠和Cre+小鼠的ACU组在Mch3.125～50mg/ml时的气道阻力增加百分比均小于ARH组，差异均具有显著性(P＜0.05或P＜0.01)；同时，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠ARH组小鼠和ACU组小鼠与相同模型的Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠相比气道阻力增加百分比值降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。
肺泡灌洗液的Elisa检测：各个组之间的TGF-β1，IL-5和TNF-α的水平，Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠，与CON组比较，ARH组各个蛋白水平升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。与ARH组比较，ACU组各个蛋白水平降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。在ARH组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠各个蛋白水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。在ACU组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠各个蛋白水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。
Masson染色结果显示：哮喘模型组，小鼠气管壁下存在广泛染蓝色的胶原蛋白，并且局部纤维化病灶的沉积，而空白对照组则没有胶原纤维沉积，针刺组小鼠气管壁下的胶原沉积与哮喘模型组相比，则胶原沉积明显减少。在ARH组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠的气管壁下胶原沉积会减少，同样在在ACU组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠的气管壁下胶原沉积也会减少。
E-cadherin蛋白和α-SMA蛋白的表达：Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠，与CON组比较，ARH组E-cadherin蛋白表达水平降低(P＜0.01)，α-SMA蛋白表达水平升高(P＜0.01)。经过针刺以后，E-cadherin蛋白表达水平升高(P＜0.01)，α-SMA蛋白表达水平降低(P＜0.01)。在ARH组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠E-cadherin蛋白表达水平升高(P＜0.01)，α-SMA蛋白表达水平降低(P＜0.01)。在ACU组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠E-cadherin蛋白表达水平升高(P＜0.05)，α-SMA蛋白表达水平降低(P＜0.01)。
免疫组化的结果，从图中可以看出，E-cadherin表达量在Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠中，CON组气道上皮阳性表达较密集，棕黄色颜色深；与CON组比较，ARH组颜色变浅，表达量下降(P＜0.01)；与ARH组比较，ACU组颜色变深，表达量升高(P＜0.01)。在ARH组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠E-cadherin蛋白阳性表达密集，颜色深，蛋白表达水平高(P＜0.05)。在ACU组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠E-cadherin蛋白阳性表达密集，颜色深，蛋白表达水平升高(P＜0.01)。α-SMA蛋白表达量，在Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠中，CON组上皮下阳性表达少，与CON组比较，ARH组上皮下，棕黄色颜色深，表达量升高(P＜0.01)；与ARH组比较，ACU组上皮下阳性表达减少，表达量降低(P＜0.01)。在ARH组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠α-SMA蛋白阳性表达不均匀，颜色浅，面积小，蛋白表达水平降低(P＜0.01)。在ACU组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠α-SMA蛋白阳性表达不均匀，颜色浅，面积小，蛋白表达水平降低(P＜0.01)。
TGF-β通路蛋白的表达：Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠，与CON组比较，ARH组TGF-β蛋白和p-Smad2蛋白表达水平升高(P＜0.01)。经过针刺以后，TGF-β通路蛋白表达水平下降(P＜0.01)。在ARH组，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠TGF-β蛋白和p-Smad2蛋白表达水平降低(P＜0.01)。在ACU组，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠TGF-β蛋白和p-Smad2蛋白表达水平降低(P＜0.05或P＜0.01)。
TGF-β1的mRNA表达水平：Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠，与CON组比较，ARH组TGF-β1的mRNA水平升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。ACU与ARH组相比，TGF-β1的mRNA水平降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。在ARH组，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠TGF-β1的mRNA水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。在ACU组，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠TGF-β1的mRNA水平降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。
在Atg5条件性敲除小鼠中，经过蛋白之间的相关性分析得到，TGF-β蛋白和α-SMA蛋表达量呈正相关(R=0.907,P＜0.01)。
结论：
Atg5条件性基因敲除能明显改善哮喘动物模型气道重塑，其机制可能跟降低TGF-β信号通路蛋白表达有关。针刺能够改善Atg5条件性基因敲除动物气道重塑，其机制可能跟降低TGF-β信号通路蛋白表达有关。
四、TGF-β和Notch信号通路在人支气管上皮细胞的上皮-间质化发挥的作用
目的：
探讨TGF-β和Notch信号通路在人支气管上皮细胞的上皮-间质化发挥的作用
方法：
人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞，用TGF-β1干预72h，TGF-β1+GSI-Ⅻ组则是用GSI-Ⅻ(10μM)和TGF-β1(5ng/ml)干预72h，使用CCK-8检测细胞活力，EdU检测细胞增殖活性，使用细胞划痕和细胞迁移实验检测细胞的迁移功能，使用鬼笔环肽染色检测对细胞骨架的影响。采用WB检测对细胞蛋白E-cadherin、α-SMA和Notch通路蛋白的影响。
结果：
CCK8结果显示：TGF-β1和GSI-Ⅻ对BEAS-2B细胞活性并没有影响(P＞0.05)。EdU检测结果显示，Con组，TGF-β1组和TGF-β1+GSI-Ⅻ组细胞增值率均在33%左右，并无差异(P＞0.05)。TGF-β1处理后，细胞之间间隙增大，细胞排列不规则，细胞边缘不清晰；细胞骨架肌动蛋白增多；在细胞划痕实验中，TGF-β1促进了划痕的愈合(P＜0.01)；在细胞迁移实验中，TGF-β1促进了BEAS-2B细胞的迁移(P＜0.01)；TGF-β1导致E-cadherin蛋白表达降低，α-SMA蛋白表达升高(P＜0.01)；TGF-β1导致Notch通路蛋白表达升高(P＜0.05或P＜0.01)。使用了GSI-Ⅻ后，抑制了TGF-β1导致的细胞划痕愈合(P＜0.01)；抑制了TGF-β1导致的细胞迁移(P＜0.01)；与TGF-β1组相比，使用了GSI-Ⅻ后，E-cadherin蛋白表达升高，α-SMA蛋白表达降低(P＜0.01)；与TGF-β1组相比，使用了GSI-Ⅻ后，Notch通路蛋白Hes-1蛋白的表达下降(P＜0.01)。
结论：
TGF-β1促进了气道上皮的上皮-间质化转变，并且激活了Notch通路，但是，使用了Notch抑制剂后，抑制了TGF-β1介导的气道上皮的上皮-间质化转变。因此，Notch通路介导了TGF-β1诱导的气道上皮的上皮-间质化转变。
针刺治疗哮喘，在我国由来已久。已经证实针刺能够改善肺功，降低哮喘患者气道高反应和气道炎症。针刺对于气道重塑的研究已经证实，针刺可以抑制豚鼠的气道平滑肌增厚。因此在此研究中，我们来探讨针刺改善气道重塑的机制。
一、哮喘动物模型建立及针刺疗效评价
目的：
1.建立哮喘动物模型
2.探究针刺对哮喘的气道高反应和气道炎症的调控作用
方法：
18只BALB/C小鼠根据随机数字表分为空白对照组，哮喘模型组和针刺治疗模型组，每组6只。哮喘模型组腹腔注射OVA和Al(OH)3致敏混悬液,最后使用OVA雾化激发。针刺模型组在致敏的基础上给小鼠针刺大椎，肺俞(双侧)和足三里(双侧)。观察小鼠的一般状态。使用小鼠RC系统检测小鼠的气道反应性，收集肺泡灌洗液进行离心，上清用于Elisa检测，沉渣用于淋巴细胞计数。小鼠肺组织进行HE病理检测。小鼠脾脏进行淋巴细胞分离并进行Th17和Treg细胞的流式检测。
结果：
哮喘模型组小鼠状态较差，在OVA致敏过程中有大小便失禁，深大腹式呼吸，喘息，呼吸困难等症状，其他两组改变不明显。
HE病理改变：空白对照组气道上皮排列整齐，无炎性细胞浸润，支气管腔内无腺体分泌。哮喘模型组小鼠的气道壁明显增厚，气道上皮排列紊乱，粘液分泌增加，大量炎性细胞浸润。针刺模型组与哮喘模型组相比则出现气道壁变薄，气道上皮排列趋于完整，粘液分泌减少。
气道反应性：哮喘模型组与空白对照组相比，乙酰甲胆碱浓度在(3.125mg/ml～50mg/ml)时气道阻力改变百分比升高，并且差异有统计学意义(P＜0.01)。针刺治疗模型组与哮喘模型组相比，乙酰甲胆碱浓度在(3.125mg/ml～50mg/ml)时气道阻力改变百分比降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。
肺泡灌洗液中的白细胞总数，哮喘模型组与空白对照组相比明显升高，针刺治疗模型组比哮喘模型组减少(P＜0.01)。细胞分类计数，与空白对照组相比，哮喘模型组的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞百分比明显升高，巨噬细胞百分比降低(均为P＜0.01)。针刺治疗模型组与哮喘模型组相比，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞百分比明显降低，巨噬细胞百分比升高(均为P＜0.01)。
Th17和Treg细胞流式结果：与空白对照组相比，哮喘模型组Th17细胞比例升高，Treg细胞比例降低(均为P＜0.01)。针刺治疗模型组与哮喘模型组相比，Th17细胞比例降低(P＜0.05)，Treg细胞比例升高(P＜0.01)。
肺泡灌洗液中细胞因子检测：与空白对照组相比，哮喘模型组TGF-β1，Notch1，IL-5和TNF-α均升高(P＜0.01)，针刺治疗模型组与哮喘模型组相比，均降低(P＜0.01)。
结论：
针刺能够降低哮喘气道高反应和气道炎症，并且能够调节Treg/Th7平衡。针刺能够治疗哮喘。
目的：
探讨针刺对哮喘气道重塑的影响及其机制
方法：
18只BALB/C小鼠根据随机数字表分为空白对照组，哮喘模型组和针刺治疗模型组，每组6只。哮喘模型组腹腔注射OVA和Al(OH)3致敏混悬液,最后使用OVA雾化激发。针刺模型组在致敏的基础上给小鼠针刺大椎，肺俞(双侧)和足三里(双侧)。采用Masson染色对小鼠的肺组织进行染色。采用免疫印迹试验检测三组的肺组织的E-cadherin、α-SMA、Notch通路和TGF-β通路蛋白。采用免疫组化法检测小鼠肺组织的E-cadherin蛋白和α-SMA蛋白。使用RT-PCR检测TGF-β通路与Notch通路mRNA。
结果：
Masson染色结果显示，哮喘模型组，小鼠气管壁下存在大量的胶原纤维沉积，呈现蓝色，而空白对照组则没有胶原纤维沉积，针刺组小鼠气管壁下的胶原沉积与哮喘模型组相比，则胶原沉积明显减少。
E-cadherin蛋白的表达：哮喘模型组比正常对照组相比，E-cadherin表达量降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比，E-cadherin表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。α-SMA蛋白的表达：哮喘模型组比正常对照组相比，α-SMA表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比，α-SMA表达量降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。
免疫组化的结果，从图中可以看出，E-cadherin表达量，CON组气道上皮阳性表达较密集，棕黄色颜色深；与CON组比较，ARH组颜色变浅，表达量下降(P＜0.01)；与ARH组比较，ACU组颜色变深，表达量升高(P＜0.01)。α-SMA蛋白表达量，CON组上皮下阳性表达少，与CON组比较，ARH组上皮下棕黄色颜色深，气道上皮下出现了明显增多的平滑肌以及肌成纤维细胞，蛋白表达量升高(P＜0.01)；与ARH组比较，ACU组上皮下阳性表达减少，表达量降低(P＜0.01)。
TGF-β通路蛋白的表达：哮喘模型组比正常对照组相比，表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比，表达量降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。Notch通路蛋白的表达：哮喘模型组比正常对照组相比，表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比，表达量降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。
针刺对TGF-β通路与Notch通路mRNA的影响：TGF-β1，Notch1和Hes-1的mRNA水平，哮喘模型组比正常对照组相比，表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比，表达量降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
TGF-β蛋白和Notch1蛋白表达量呈正相关(R=0.856,P＜0.01)；TGF-β蛋白和α-SMA蛋白表达量呈正相关(R=0.755,P＜0.01)；Notch1蛋白和α-SMA蛋白表达量呈正相关(R=0.936,P＜0.01)。
结论：
针刺大椎、肺俞和足三里可以降低气道高反应，针刺能够下调哮喘模型中的TGF-β通路与Notch通路。
三、探讨针刺对Atg5条件性基因敲除小鼠哮喘模型气道重塑的调控及其机制
目的：
探讨针刺对Atg5条件性基因敲除小鼠哮喘模型的气道重塑的调控及其机制
方法：
18只Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠为基因敲除小鼠阴性对照组根据随机数字表分为3组,CON(Cre-)组(空白对照组)、ARH(Cre-)组(哮喘模型组)，ACU(Cre-)组(针刺治疗组)每组6只。18只ATG5flox/floxCD4+Cre+基因敲除小鼠根据随机数字表分为3组，CON(Cre+)组(Atg5条件性基因敲除鼠空白对照组)、ARH(Cre+)组(Atg5条件性基因敲除鼠哮喘模型组)；ACU(Cre+)组(Atg5条件性基因敲除鼠针刺治疗组)。哮喘模型组腹腔注射OVA和Al(OH)3致敏混悬液,最后使用OVA雾化激发。针刺模型组在致敏的基础上给小鼠针刺大椎，肺俞(双侧)和足三里(双侧)。使用小鼠RC系统检测小鼠的气道反应性。小鼠肺组织进行HE病理检测。采用Masson染色对小鼠的肺组织进行染色。使用Elisa检测肺泡灌洗液中细胞因子。采用WB方法检测小鼠肺组织的E-cadherin、α-SMA和TGF-β通路蛋白。采用免疫组化法检测小鼠肺组织的E-cadherin蛋白和α-SMA蛋白。使用RT-PCR检测TGF-β1mRNA。
结果：
HE病理改变。Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠的肺组织病理改变：CON(Cre-)组小鼠气道上皮细胞排列整齐，气道壁厚薄均匀，周围无炎性细胞浸润。ARH(Cre-)组小鼠的肺组织病理图片显示气道壁明显增厚，气道平滑肌增生，气道上皮排列紊乱，脱落，杯状细胞化生，粘液分泌增加，大量炎性细胞浸润，在气管，血管，肺泡内，均可见到粘液分泌增加，气管管腔变窄。ACU(Cre-)组与哮喘模型组相比则出现气道壁变薄，气道平滑肌增生减弱，气道上皮趋于完整，粘液分泌减少，炎性细胞浸润明显减少，肺泡内分泌物也明显减少。Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠的肺组织病理改变：CON(Cre+)组小鼠气道平滑肌规则，支气管腔内无腺体分泌,肺组织无炎性细胞浸润。ARH(Cre+)组小鼠的肺组织病理图片显示气道壁轻微增厚，气道平滑肌可见增生，有一定数量的炎性细胞浸润，气管管腔内可见分泌物，但是比Atg5flox/floxCD4+Cre-组小鼠的ARH(Cre-)组破坏程度要轻。ACU(Cre+)组未见明显的杯状细胞化生，炎性细胞浸润明显减少，气道上皮排列趋于完整，病理学改变较ACU(Cre-)组改善明显。
气道反应性：Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠在Mch3.125～50mg/ml时，ARH组气道阻力增加百分比均明显高于CON组(P＜0.01)；经针刺治疗后，Cre-小鼠和Cre+小鼠的ACU组在Mch3.125～50mg/ml时的气道阻力增加百分比均小于ARH组，差异均具有显著性(P＜0.05或P＜0.01)；同时，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠ARH组小鼠和ACU组小鼠与相同模型的Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠相比气道阻力增加百分比值降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。
肺泡灌洗液的Elisa检测：各个组之间的TGF-β1，IL-5和TNF-α的水平，Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠，与CON组比较，ARH组各个蛋白水平升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。与ARH组比较，ACU组各个蛋白水平降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。在ARH组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠各个蛋白水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。在ACU组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠各个蛋白水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。
Masson染色结果显示：哮喘模型组，小鼠气管壁下存在广泛染蓝色的胶原蛋白，并且局部纤维化病灶的沉积，而空白对照组则没有胶原纤维沉积，针刺组小鼠气管壁下的胶原沉积与哮喘模型组相比，则胶原沉积明显减少。在ARH组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠的气管壁下胶原沉积会减少，同样在在ACU组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠的气管壁下胶原沉积也会减少。
E-cadherin蛋白和α-SMA蛋白的表达：Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠，与CON组比较，ARH组E-cadherin蛋白表达水平降低(P＜0.01)，α-SMA蛋白表达水平升高(P＜0.01)。经过针刺以后，E-cadherin蛋白表达水平升高(P＜0.01)，α-SMA蛋白表达水平降低(P＜0.01)。在ARH组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠E-cadherin蛋白表达水平升高(P＜0.01)，α-SMA蛋白表达水平降低(P＜0.01)。在ACU组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠E-cadherin蛋白表达水平升高(P＜0.05)，α-SMA蛋白表达水平降低(P＜0.01)。
免疫组化的结果，从图中可以看出，E-cadherin表达量在Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠中，CON组气道上皮阳性表达较密集，棕黄色颜色深；与CON组比较，ARH组颜色变浅，表达量下降(P＜0.01)；与ARH组比较，ACU组颜色变深，表达量升高(P＜0.01)。在ARH组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠E-cadherin蛋白阳性表达密集，颜色深，蛋白表达水平高(P＜0.05)。在ACU组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠E-cadherin蛋白阳性表达密集，颜色深，蛋白表达水平升高(P＜0.01)。α-SMA蛋白表达量，在Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠中，CON组上皮下阳性表达少，与CON组比较，ARH组上皮下，棕黄色颜色深，表达量升高(P＜0.01)；与ARH组比较，ACU组上皮下阳性表达减少，表达量降低(P＜0.01)。在ARH组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠α-SMA蛋白阳性表达不均匀，颜色浅，面积小，蛋白表达水平降低(P＜0.01)。在ACU组中，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠α-SMA蛋白阳性表达不均匀，颜色浅，面积小，蛋白表达水平降低(P＜0.01)。
TGF-β通路蛋白的表达：Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠，与CON组比较，ARH组TGF-β蛋白和p-Smad2蛋白表达水平升高(P＜0.01)。经过针刺以后，TGF-β通路蛋白表达水平下降(P＜0.01)。在ARH组，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠TGF-β蛋白和p-Smad2蛋白表达水平降低(P＜0.01)。在ACU组，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠TGF-β蛋白和p-Smad2蛋白表达水平降低(P＜0.05或P＜0.01)。
TGF-β1的mRNA表达水平：Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠，与CON组比较，ARH组TGF-β1的mRNA水平升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。ACU与ARH组相比，TGF-β1的mRNA水平降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。在ARH组，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠TGF-β1的mRNA水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。在ACU组，与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较，Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠TGF-β1的mRNA水平降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。
在Atg5条件性敲除小鼠中，经过蛋白之间的相关性分析得到，TGF-β蛋白和α-SMA蛋表达量呈正相关(R=0.907,P＜0.01)。
结论：
Atg5条件性基因敲除能明显改善哮喘动物模型气道重塑，其机制可能跟降低TGF-β信号通路蛋白表达有关。针刺能够改善Atg5条件性基因敲除动物气道重塑，其机制可能跟降低TGF-β信号通路蛋白表达有关。
四、TGF-β和Notch信号通路在人支气管上皮细胞的上皮-间质化发挥的作用
目的：
探讨TGF-β和Notch信号通路在人支气管上皮细胞的上皮-间质化发挥的作用
方法：
人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞，用TGF-β1干预72h，TGF-β1+GSI-Ⅻ组则是用GSI-Ⅻ(10μM)和TGF-β1(5ng/ml)干预72h，使用CCK-8检测细胞活力，EdU检测细胞增殖活性，使用细胞划痕和细胞迁移实验检测细胞的迁移功能，使用鬼笔环肽染色检测对细胞骨架的影响。采用WB检测对细胞蛋白E-cadherin、α-SMA和Notch通路蛋白的影响。
结果：
CCK8结果显示：TGF-β1和GSI-Ⅻ对BEAS-2B细胞活性并没有影响(P＞0.05)。EdU检测结果显示，Con组，TGF-β1组和TGF-β1+GSI-Ⅻ组细胞增值率均在33%左右，并无差异(P＞0.05)。TGF-β1处理后，细胞之间间隙增大，细胞排列不规则，细胞边缘不清晰；细胞骨架肌动蛋白增多；在细胞划痕实验中，TGF-β1促进了划痕的愈合(P＜0.01)；在细胞迁移实验中，TGF-β1促进了BEAS-2B细胞的迁移(P＜0.01)；TGF-β1导致E-cadherin蛋白表达降低，α-SMA蛋白表达升高(P＜0.01)；TGF-β1导致Notch通路蛋白表达升高(P＜0.05或P＜0.01)。使用了GSI-Ⅻ后，抑制了TGF-β1导致的细胞划痕愈合(P＜0.01)；抑制了TGF-β1导致的细胞迁移(P＜0.01)；与TGF-β1组相比，使用了GSI-Ⅻ后，E-cadherin蛋白表达升高，α-SMA蛋白表达降低(P＜0.01)；与TGF-β1组相比，使用了GSI-Ⅻ后，Notch通路蛋白Hes-1蛋白的表达下降(P＜0.01)。
结论：
TGF-β1促进了气道上皮的上皮-间质化转变，并且激活了Notch通路，但是，使用了Notch抑制剂后，抑制了TGF-β1介导的气道上皮的上皮-间质化转变。因此，Notch通路介导了TGF-β1诱导的气道上皮的上皮-间质化转变。