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哮喘是一种常见的非传染性气道炎症疾病,气道高反应,气道重塑和气流受限为其主要特征。大部分病例发生在低收入国家或低中收入国家。根据世界卫生组织在2016年12月公布的,大约有235百万人患哮喘,在2015年有383000死亡病例,带来严重的经济负担和社会负担。哮喘发展的最危险因素是吸入的物质,例如花粉和尘螨,可能会引起过敏反应或者刺激气道。哮喘病人在临床上表现为反复发作的喘息,咳嗽,胸闷和气短,并且这些过程通常伴有肺部的气道阻塞,通过治疗或自行缓解。哮喘为异质性疾病,每个患者及不同的时间表现均不同。因此给哮喘发病机制的研究和治疗提出了很大的挑战。气道重塑是由于长期的慢性炎症导致,包括上皮脱落,上皮结构排列紊乱,上皮下胶原沉积,基底膜肥厚增生,粘液分泌增多,气道平滑肌增多,管腔狭窄。并且,针对哮喘的气道重塑治疗效果较差。因此,对哮喘气道重塑治疗的研究有重要的医疗价值。
针刺治疗哮喘,在我国由来已久。已经证实针刺能够改善肺功,降低哮喘患者气道高反应和气道炎症。针刺对于气道重塑的研究已经证实,针刺可以抑制豚鼠的气道平滑肌增厚。因此在此研究中,我们来探讨针刺改善气道重塑的机制。
一、哮喘动物模型建立及针刺疗效评价
目的:
1.建立哮喘动物模型
2.探究针刺对哮喘的气道高反应和气道炎症的调控作用
方法:
18只BALB/C小鼠根据随机数字表分为空白对照组,哮喘模型组和针刺治疗模型组,每组6只。哮喘模型组腹腔注射OVA和Al(OH)3致敏混悬液,最后使用OVA雾化激发。针刺模型组在致敏的基础上给小鼠针刺大椎,肺俞(双侧)和足三里(双侧)。观察小鼠的一般状态。使用小鼠RC系统检测小鼠的气道反应性,收集肺泡灌洗液进行离心,上清用于Elisa检测,沉渣用于淋巴细胞计数。小鼠肺组织进行HE病理检测。小鼠脾脏进行淋巴细胞分离并进行Th17和Treg细胞的流式检测。
结果:
哮喘模型组小鼠状态较差,在OVA致敏过程中有大小便失禁,深大腹式呼吸,喘息,呼吸困难等症状,其他两组改变不明显。
HE病理改变:空白对照组气道上皮排列整齐,无炎性细胞浸润,支气管腔内无腺体分泌。哮喘模型组小鼠的气道壁明显增厚,气道上皮排列紊乱,粘液分泌增加,大量炎性细胞浸润。针刺模型组与哮喘模型组相比则出现气道壁变薄,气道上皮排列趋于完整,粘液分泌减少。
气道反应性:哮喘模型组与空白对照组相比,乙酰甲胆碱浓度在(3.125mg/ml~50mg/ml)时气道阻力改变百分比升高,并且差异有统计学意义(P<0.01)。针刺治疗模型组与哮喘模型组相比,乙酰甲胆碱浓度在(3.125mg/ml~50mg/ml)时气道阻力改变百分比降低,差异有统计学意义(P<0.01)。
肺泡灌洗液中的白细胞总数,哮喘模型组与空白对照组相比明显升高,针刺治疗模型组比哮喘模型组减少(P<0.01)。细胞分类计数,与空白对照组相比,哮喘模型组的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞百分比明显升高,巨噬细胞百分比降低(均为P<0.01)。针刺治疗模型组与哮喘模型组相比,中性粒细胞和嗜酸性粒细胞百分比明显降低,巨噬细胞百分比升高(均为P<0.01)。
Th17和Treg细胞流式结果:与空白对照组相比,哮喘模型组Th17细胞比例升高,Treg细胞比例降低(均为P<0.01)。针刺治疗模型组与哮喘模型组相比,Th17细胞比例降低(P<0.05),Treg细胞比例升高(P<0.01)。
肺泡灌洗液中细胞因子检测:与空白对照组相比,哮喘模型组TGF-β1,Notch1,IL-5和TNF-α均升高(P<0.01),针刺治疗模型组与哮喘模型组相比,均降低(P<0.01)。
结论:
针刺能够降低哮喘气道高反应和气道炎症,并且能够调节Treg/Th7平衡。针刺能够治疗哮喘。
目的:
探讨针刺对哮喘气道重塑的影响及其机制
方法:
18只BALB/C小鼠根据随机数字表分为空白对照组,哮喘模型组和针刺治疗模型组,每组6只。哮喘模型组腹腔注射OVA和Al(OH)3致敏混悬液,最后使用OVA雾化激发。针刺模型组在致敏的基础上给小鼠针刺大椎,肺俞(双侧)和足三里(双侧)。采用Masson染色对小鼠的肺组织进行染色。采用免疫印迹试验检测三组的肺组织的E-cadherin、α-SMA、Notch通路和TGF-β通路蛋白。采用免疫组化法检测小鼠肺组织的E-cadherin蛋白和α-SMA蛋白。使用RT-PCR检测TGF-β通路与Notch通路mRNA。
结果:
Masson染色结果显示,哮喘模型组,小鼠气管壁下存在大量的胶原纤维沉积,呈现蓝色,而空白对照组则没有胶原纤维沉积,针刺组小鼠气管壁下的胶原沉积与哮喘模型组相比,则胶原沉积明显减少。
E-cadherin蛋白的表达:哮喘模型组比正常对照组相比,E-cadherin表达量降低,差异有统计学意义(P<0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比,E-cadherin表达量升高,差异有统计学意义(P<0.01)。α-SMA蛋白的表达:哮喘模型组比正常对照组相比,α-SMA表达量升高,差异有统计学意义(P<0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比,α-SMA表达量降低,差异有统计学意义(P<0.01)。
免疫组化的结果,从图中可以看出,E-cadherin表达量,CON组气道上皮阳性表达较密集,棕黄色颜色深;与CON组比较,ARH组颜色变浅,表达量下降(P<0.01);与ARH组比较,ACU组颜色变深,表达量升高(P<0.01)。α-SMA蛋白表达量,CON组上皮下阳性表达少,与CON组比较,ARH组上皮下棕黄色颜色深,气道上皮下出现了明显增多的平滑肌以及肌成纤维细胞,蛋白表达量升高(P<0.01);与ARH组比较,ACU组上皮下阳性表达减少,表达量降低(P<0.01)。
TGF-β通路蛋白的表达:哮喘模型组比正常对照组相比,表达量升高,差异有统计学意义(P<0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比,表达量降低,差异有统计学意义(P<0.01)。Notch通路蛋白的表达:哮喘模型组比正常对照组相比,表达量升高,差异有统计学意义(P<0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比,表达量降低,差异有统计学意义(P<0.01)。
针刺对TGF-β通路与Notch通路mRNA的影响:TGF-β1,Notch1和Hes-1的mRNA水平,哮喘模型组比正常对照组相比,表达量升高,差异有统计学意义(P<0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比,表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。
TGF-β蛋白和Notch1蛋白表达量呈正相关(R=0.856,P<0.01);TGF-β蛋白和α-SMA蛋白表达量呈正相关(R=0.755,P<0.01);Notch1蛋白和α-SMA蛋白表达量呈正相关(R=0.936,P<0.01)。
结论:
针刺大椎、肺俞和足三里可以降低气道高反应,针刺能够下调哮喘模型中的TGF-β通路与Notch通路。
三、探讨针刺对Atg5条件性基因敲除小鼠哮喘模型气道重塑的调控及其机制
目的:
探讨针刺对Atg5条件性基因敲除小鼠哮喘模型的气道重塑的调控及其机制
方法:
18只Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠为基因敲除小鼠阴性对照组根据随机数字表分为3组,CON(Cre-)组(空白对照组)、ARH(Cre-)组(哮喘模型组),ACU(Cre-)组(针刺治疗组)每组6只。18只ATG5flox/floxCD4+Cre+基因敲除小鼠根据随机数字表分为3组,CON(Cre+)组(Atg5条件性基因敲除鼠空白对照组)、ARH(Cre+)组(Atg5条件性基因敲除鼠哮喘模型组);ACU(Cre+)组(Atg5条件性基因敲除鼠针刺治疗组)。哮喘模型组腹腔注射OVA和Al(OH)3致敏混悬液,最后使用OVA雾化激发。针刺模型组在致敏的基础上给小鼠针刺大椎,肺俞(双侧)和足三里(双侧)。使用小鼠RC系统检测小鼠的气道反应性。小鼠肺组织进行HE病理检测。采用Masson染色对小鼠的肺组织进行染色。使用Elisa检测肺泡灌洗液中细胞因子。采用WB方法检测小鼠肺组织的E-cadherin、α-SMA和TGF-β通路蛋白。采用免疫组化法检测小鼠肺组织的E-cadherin蛋白和α-SMA蛋白。使用RT-PCR检测TGF-β1mRNA。
结果:
HE病理改变。Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠的肺组织病理改变:CON(Cre-)组小鼠气道上皮细胞排列整齐,气道壁厚薄均匀,周围无炎性细胞浸润。ARH(Cre-)组小鼠的肺组织病理图片显示气道壁明显增厚,气道平滑肌增生,气道上皮排列紊乱,脱落,杯状细胞化生,粘液分泌增加,大量炎性细胞浸润,在气管,血管,肺泡内,均可见到粘液分泌增加,气管管腔变窄。ACU(Cre-)组与哮喘模型组相比则出现气道壁变薄,气道平滑肌增生减弱,气道上皮趋于完整,粘液分泌减少,炎性细胞浸润明显减少,肺泡内分泌物也明显减少。Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠的肺组织病理改变:CON(Cre+)组小鼠气道平滑肌规则,支气管腔内无腺体分泌,肺组织无炎性细胞浸润。ARH(Cre+)组小鼠的肺组织病理图片显示气道壁轻微增厚,气道平滑肌可见增生,有一定数量的炎性细胞浸润,气管管腔内可见分泌物,但是比Atg5flox/floxCD4+Cre-组小鼠的ARH(Cre-)组破坏程度要轻。ACU(Cre+)组未见明显的杯状细胞化生,炎性细胞浸润明显减少,气道上皮排列趋于完整,病理学改变较ACU(Cre-)组改善明显。
气道反应性:Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠在Mch3.125~50mg/ml时,ARH组气道阻力增加百分比均明显高于CON组(P<0.01);经针刺治疗后,Cre-小鼠和Cre+小鼠的ACU组在Mch3.125~50mg/ml时的气道阻力增加百分比均小于ARH组,差异均具有显著性(P<0.05或P<0.01);同时,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠ARH组小鼠和ACU组小鼠与相同模型的Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠相比气道阻力增加百分比值降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
肺泡灌洗液的Elisa检测:各个组之间的TGF-β1,IL-5和TNF-α的水平,Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠,与CON组比较,ARH组各个蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与ARH组比较,ACU组各个蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。在ARH组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠各个蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。在ACU组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠各个蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
Masson染色结果显示:哮喘模型组,小鼠气管壁下存在广泛染蓝色的胶原蛋白,并且局部纤维化病灶的沉积,而空白对照组则没有胶原纤维沉积,针刺组小鼠气管壁下的胶原沉积与哮喘模型组相比,则胶原沉积明显减少。在ARH组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠的气管壁下胶原沉积会减少,同样在在ACU组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠的气管壁下胶原沉积也会减少。
E-cadherin蛋白和α-SMA蛋白的表达:Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠,与CON组比较,ARH组E-cadherin蛋白表达水平降低(P<0.01),α-SMA蛋白表达水平升高(P<0.01)。经过针刺以后,E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.01),α-SMA蛋白表达水平降低(P<0.01)。在ARH组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.01),α-SMA蛋白表达水平降低(P<0.01)。在ACU组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.05),α-SMA蛋白表达水平降低(P<0.01)。
免疫组化的结果,从图中可以看出,E-cadherin表达量在Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠中,CON组气道上皮阳性表达较密集,棕黄色颜色深;与CON组比较,ARH组颜色变浅,表达量下降(P<0.01);与ARH组比较,ACU组颜色变深,表达量升高(P<0.01)。在ARH组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠E-cadherin蛋白阳性表达密集,颜色深,蛋白表达水平高(P<0.05)。在ACU组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠E-cadherin蛋白阳性表达密集,颜色深,蛋白表达水平升高(P<0.01)。α-SMA蛋白表达量,在Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠中,CON组上皮下阳性表达少,与CON组比较,ARH组上皮下,棕黄色颜色深,表达量升高(P<0.01);与ARH组比较,ACU组上皮下阳性表达减少,表达量降低(P<0.01)。在ARH组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠α-SMA蛋白阳性表达不均匀,颜色浅,面积小,蛋白表达水平降低(P<0.01)。在ACU组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠α-SMA蛋白阳性表达不均匀,颜色浅,面积小,蛋白表达水平降低(P<0.01)。
TGF-β通路蛋白的表达:Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠,与CON组比较,ARH组TGF-β蛋白和p-Smad2蛋白表达水平升高(P<0.01)。经过针刺以后,TGF-β通路蛋白表达水平下降(P<0.01)。在ARH组,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠TGF-β蛋白和p-Smad2蛋白表达水平降低(P<0.01)。在ACU组,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠TGF-β蛋白和p-Smad2蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01)。
TGF-β1的mRNA表达水平:Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠,与CON组比较,ARH组TGF-β1的mRNA水平升高,差异有统计学意义(P<0.01)。ACU与ARH组相比,TGF-β1的mRNA水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。在ARH组,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠TGF-β1的mRNA水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。在ACU组,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠TGF-β1的mRNA水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。
在Atg5条件性敲除小鼠中,经过蛋白之间的相关性分析得到,TGF-β蛋白和α-SMA蛋表达量呈正相关(R=0.907,P<0.01)。
结论:
Atg5条件性基因敲除能明显改善哮喘动物模型气道重塑,其机制可能跟降低TGF-β信号通路蛋白表达有关。针刺能够改善Atg5条件性基因敲除动物气道重塑,其机制可能跟降低TGF-β信号通路蛋白表达有关。
四、TGF-β和Notch信号通路在人支气管上皮细胞的上皮-间质化发挥的作用
目的:
探讨TGF-β和Notch信号通路在人支气管上皮细胞的上皮-间质化发挥的作用
方法:
人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞,用TGF-β1干预72h,TGF-β1+GSI-Ⅻ组则是用GSI-Ⅻ(10μM)和TGF-β1(5ng/ml)干预72h,使用CCK-8检测细胞活力,EdU检测细胞增殖活性,使用细胞划痕和细胞迁移实验检测细胞的迁移功能,使用鬼笔环肽染色检测对细胞骨架的影响。采用WB检测对细胞蛋白E-cadherin、α-SMA和Notch通路蛋白的影响。
结果:
CCK8结果显示:TGF-β1和GSI-Ⅻ对BEAS-2B细胞活性并没有影响(P>0.05)。EdU检测结果显示,Con组,TGF-β1组和TGF-β1+GSI-Ⅻ组细胞增值率均在33%左右,并无差异(P>0.05)。TGF-β1处理后,细胞之间间隙增大,细胞排列不规则,细胞边缘不清晰;细胞骨架肌动蛋白增多;在细胞划痕实验中,TGF-β1促进了划痕的愈合(P<0.01);在细胞迁移实验中,TGF-β1促进了BEAS-2B细胞的迁移(P<0.01);TGF-β1导致E-cadherin蛋白表达降低,α-SMA蛋白表达升高(P<0.01);TGF-β1导致Notch通路蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01)。使用了GSI-Ⅻ后,抑制了TGF-β1导致的细胞划痕愈合(P<0.01);抑制了TGF-β1导致的细胞迁移(P<0.01);与TGF-β1组相比,使用了GSI-Ⅻ后,E-cadherin蛋白表达升高,α-SMA蛋白表达降低(P<0.01);与TGF-β1组相比,使用了GSI-Ⅻ后,Notch通路蛋白Hes-1蛋白的表达下降(P<0.01)。
结论:
TGF-β1促进了气道上皮的上皮-间质化转变,并且激活了Notch通路,但是,使用了Notch抑制剂后,抑制了TGF-β1介导的气道上皮的上皮-间质化转变。因此,Notch通路介导了TGF-β1诱导的气道上皮的上皮-间质化转变。
针刺治疗哮喘,在我国由来已久。已经证实针刺能够改善肺功,降低哮喘患者气道高反应和气道炎症。针刺对于气道重塑的研究已经证实,针刺可以抑制豚鼠的气道平滑肌增厚。因此在此研究中,我们来探讨针刺改善气道重塑的机制。
一、哮喘动物模型建立及针刺疗效评价
目的:
1.建立哮喘动物模型
2.探究针刺对哮喘的气道高反应和气道炎症的调控作用
方法:
18只BALB/C小鼠根据随机数字表分为空白对照组,哮喘模型组和针刺治疗模型组,每组6只。哮喘模型组腹腔注射OVA和Al(OH)3致敏混悬液,最后使用OVA雾化激发。针刺模型组在致敏的基础上给小鼠针刺大椎,肺俞(双侧)和足三里(双侧)。观察小鼠的一般状态。使用小鼠RC系统检测小鼠的气道反应性,收集肺泡灌洗液进行离心,上清用于Elisa检测,沉渣用于淋巴细胞计数。小鼠肺组织进行HE病理检测。小鼠脾脏进行淋巴细胞分离并进行Th17和Treg细胞的流式检测。
结果:
哮喘模型组小鼠状态较差,在OVA致敏过程中有大小便失禁,深大腹式呼吸,喘息,呼吸困难等症状,其他两组改变不明显。
HE病理改变:空白对照组气道上皮排列整齐,无炎性细胞浸润,支气管腔内无腺体分泌。哮喘模型组小鼠的气道壁明显增厚,气道上皮排列紊乱,粘液分泌增加,大量炎性细胞浸润。针刺模型组与哮喘模型组相比则出现气道壁变薄,气道上皮排列趋于完整,粘液分泌减少。
气道反应性:哮喘模型组与空白对照组相比,乙酰甲胆碱浓度在(3.125mg/ml~50mg/ml)时气道阻力改变百分比升高,并且差异有统计学意义(P<0.01)。针刺治疗模型组与哮喘模型组相比,乙酰甲胆碱浓度在(3.125mg/ml~50mg/ml)时气道阻力改变百分比降低,差异有统计学意义(P<0.01)。
肺泡灌洗液中的白细胞总数,哮喘模型组与空白对照组相比明显升高,针刺治疗模型组比哮喘模型组减少(P<0.01)。细胞分类计数,与空白对照组相比,哮喘模型组的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞百分比明显升高,巨噬细胞百分比降低(均为P<0.01)。针刺治疗模型组与哮喘模型组相比,中性粒细胞和嗜酸性粒细胞百分比明显降低,巨噬细胞百分比升高(均为P<0.01)。
Th17和Treg细胞流式结果:与空白对照组相比,哮喘模型组Th17细胞比例升高,Treg细胞比例降低(均为P<0.01)。针刺治疗模型组与哮喘模型组相比,Th17细胞比例降低(P<0.05),Treg细胞比例升高(P<0.01)。
肺泡灌洗液中细胞因子检测:与空白对照组相比,哮喘模型组TGF-β1,Notch1,IL-5和TNF-α均升高(P<0.01),针刺治疗模型组与哮喘模型组相比,均降低(P<0.01)。
结论:
针刺能够降低哮喘气道高反应和气道炎症,并且能够调节Treg/Th7平衡。针刺能够治疗哮喘。
目的:
探讨针刺对哮喘气道重塑的影响及其机制
方法:
18只BALB/C小鼠根据随机数字表分为空白对照组,哮喘模型组和针刺治疗模型组,每组6只。哮喘模型组腹腔注射OVA和Al(OH)3致敏混悬液,最后使用OVA雾化激发。针刺模型组在致敏的基础上给小鼠针刺大椎,肺俞(双侧)和足三里(双侧)。采用Masson染色对小鼠的肺组织进行染色。采用免疫印迹试验检测三组的肺组织的E-cadherin、α-SMA、Notch通路和TGF-β通路蛋白。采用免疫组化法检测小鼠肺组织的E-cadherin蛋白和α-SMA蛋白。使用RT-PCR检测TGF-β通路与Notch通路mRNA。
结果:
Masson染色结果显示,哮喘模型组,小鼠气管壁下存在大量的胶原纤维沉积,呈现蓝色,而空白对照组则没有胶原纤维沉积,针刺组小鼠气管壁下的胶原沉积与哮喘模型组相比,则胶原沉积明显减少。
E-cadherin蛋白的表达:哮喘模型组比正常对照组相比,E-cadherin表达量降低,差异有统计学意义(P<0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比,E-cadherin表达量升高,差异有统计学意义(P<0.01)。α-SMA蛋白的表达:哮喘模型组比正常对照组相比,α-SMA表达量升高,差异有统计学意义(P<0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比,α-SMA表达量降低,差异有统计学意义(P<0.01)。
免疫组化的结果,从图中可以看出,E-cadherin表达量,CON组气道上皮阳性表达较密集,棕黄色颜色深;与CON组比较,ARH组颜色变浅,表达量下降(P<0.01);与ARH组比较,ACU组颜色变深,表达量升高(P<0.01)。α-SMA蛋白表达量,CON组上皮下阳性表达少,与CON组比较,ARH组上皮下棕黄色颜色深,气道上皮下出现了明显增多的平滑肌以及肌成纤维细胞,蛋白表达量升高(P<0.01);与ARH组比较,ACU组上皮下阳性表达减少,表达量降低(P<0.01)。
TGF-β通路蛋白的表达:哮喘模型组比正常对照组相比,表达量升高,差异有统计学意义(P<0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比,表达量降低,差异有统计学意义(P<0.01)。Notch通路蛋白的表达:哮喘模型组比正常对照组相比,表达量升高,差异有统计学意义(P<0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比,表达量降低,差异有统计学意义(P<0.01)。
针刺对TGF-β通路与Notch通路mRNA的影响:TGF-β1,Notch1和Hes-1的mRNA水平,哮喘模型组比正常对照组相比,表达量升高,差异有统计学意义(P<0.01)。针刺治疗组与哮喘模型组相比,表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。
TGF-β蛋白和Notch1蛋白表达量呈正相关(R=0.856,P<0.01);TGF-β蛋白和α-SMA蛋白表达量呈正相关(R=0.755,P<0.01);Notch1蛋白和α-SMA蛋白表达量呈正相关(R=0.936,P<0.01)。
结论:
针刺大椎、肺俞和足三里可以降低气道高反应,针刺能够下调哮喘模型中的TGF-β通路与Notch通路。
三、探讨针刺对Atg5条件性基因敲除小鼠哮喘模型气道重塑的调控及其机制
目的:
探讨针刺对Atg5条件性基因敲除小鼠哮喘模型的气道重塑的调控及其机制
方法:
18只Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠为基因敲除小鼠阴性对照组根据随机数字表分为3组,CON(Cre-)组(空白对照组)、ARH(Cre-)组(哮喘模型组),ACU(Cre-)组(针刺治疗组)每组6只。18只ATG5flox/floxCD4+Cre+基因敲除小鼠根据随机数字表分为3组,CON(Cre+)组(Atg5条件性基因敲除鼠空白对照组)、ARH(Cre+)组(Atg5条件性基因敲除鼠哮喘模型组);ACU(Cre+)组(Atg5条件性基因敲除鼠针刺治疗组)。哮喘模型组腹腔注射OVA和Al(OH)3致敏混悬液,最后使用OVA雾化激发。针刺模型组在致敏的基础上给小鼠针刺大椎,肺俞(双侧)和足三里(双侧)。使用小鼠RC系统检测小鼠的气道反应性。小鼠肺组织进行HE病理检测。采用Masson染色对小鼠的肺组织进行染色。使用Elisa检测肺泡灌洗液中细胞因子。采用WB方法检测小鼠肺组织的E-cadherin、α-SMA和TGF-β通路蛋白。采用免疫组化法检测小鼠肺组织的E-cadherin蛋白和α-SMA蛋白。使用RT-PCR检测TGF-β1mRNA。
结果:
HE病理改变。Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠的肺组织病理改变:CON(Cre-)组小鼠气道上皮细胞排列整齐,气道壁厚薄均匀,周围无炎性细胞浸润。ARH(Cre-)组小鼠的肺组织病理图片显示气道壁明显增厚,气道平滑肌增生,气道上皮排列紊乱,脱落,杯状细胞化生,粘液分泌增加,大量炎性细胞浸润,在气管,血管,肺泡内,均可见到粘液分泌增加,气管管腔变窄。ACU(Cre-)组与哮喘模型组相比则出现气道壁变薄,气道平滑肌增生减弱,气道上皮趋于完整,粘液分泌减少,炎性细胞浸润明显减少,肺泡内分泌物也明显减少。Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠的肺组织病理改变:CON(Cre+)组小鼠气道平滑肌规则,支气管腔内无腺体分泌,肺组织无炎性细胞浸润。ARH(Cre+)组小鼠的肺组织病理图片显示气道壁轻微增厚,气道平滑肌可见增生,有一定数量的炎性细胞浸润,气管管腔内可见分泌物,但是比Atg5flox/floxCD4+Cre-组小鼠的ARH(Cre-)组破坏程度要轻。ACU(Cre+)组未见明显的杯状细胞化生,炎性细胞浸润明显减少,气道上皮排列趋于完整,病理学改变较ACU(Cre-)组改善明显。
气道反应性:Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠在Mch3.125~50mg/ml时,ARH组气道阻力增加百分比均明显高于CON组(P<0.01);经针刺治疗后,Cre-小鼠和Cre+小鼠的ACU组在Mch3.125~50mg/ml时的气道阻力增加百分比均小于ARH组,差异均具有显著性(P<0.05或P<0.01);同时,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠ARH组小鼠和ACU组小鼠与相同模型的Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠相比气道阻力增加百分比值降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
肺泡灌洗液的Elisa检测:各个组之间的TGF-β1,IL-5和TNF-α的水平,Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠,与CON组比较,ARH组各个蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与ARH组比较,ACU组各个蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。在ARH组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠各个蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。在ACU组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠各个蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
Masson染色结果显示:哮喘模型组,小鼠气管壁下存在广泛染蓝色的胶原蛋白,并且局部纤维化病灶的沉积,而空白对照组则没有胶原纤维沉积,针刺组小鼠气管壁下的胶原沉积与哮喘模型组相比,则胶原沉积明显减少。在ARH组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠的气管壁下胶原沉积会减少,同样在在ACU组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠的气管壁下胶原沉积也会减少。
E-cadherin蛋白和α-SMA蛋白的表达:Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠,与CON组比较,ARH组E-cadherin蛋白表达水平降低(P<0.01),α-SMA蛋白表达水平升高(P<0.01)。经过针刺以后,E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.01),α-SMA蛋白表达水平降低(P<0.01)。在ARH组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.01),α-SMA蛋白表达水平降低(P<0.01)。在ACU组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.05),α-SMA蛋白表达水平降低(P<0.01)。
免疫组化的结果,从图中可以看出,E-cadherin表达量在Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠中,CON组气道上皮阳性表达较密集,棕黄色颜色深;与CON组比较,ARH组颜色变浅,表达量下降(P<0.01);与ARH组比较,ACU组颜色变深,表达量升高(P<0.01)。在ARH组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠E-cadherin蛋白阳性表达密集,颜色深,蛋白表达水平高(P<0.05)。在ACU组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠E-cadherin蛋白阳性表达密集,颜色深,蛋白表达水平升高(P<0.01)。α-SMA蛋白表达量,在Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠中,CON组上皮下阳性表达少,与CON组比较,ARH组上皮下,棕黄色颜色深,表达量升高(P<0.01);与ARH组比较,ACU组上皮下阳性表达减少,表达量降低(P<0.01)。在ARH组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠α-SMA蛋白阳性表达不均匀,颜色浅,面积小,蛋白表达水平降低(P<0.01)。在ACU组中,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠α-SMA蛋白阳性表达不均匀,颜色浅,面积小,蛋白表达水平降低(P<0.01)。
TGF-β通路蛋白的表达:Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠,与CON组比较,ARH组TGF-β蛋白和p-Smad2蛋白表达水平升高(P<0.01)。经过针刺以后,TGF-β通路蛋白表达水平下降(P<0.01)。在ARH组,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠TGF-β蛋白和p-Smad2蛋白表达水平降低(P<0.01)。在ACU组,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠TGF-β蛋白和p-Smad2蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01)。
TGF-β1的mRNA表达水平:Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠和Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠,与CON组比较,ARH组TGF-β1的mRNA水平升高,差异有统计学意义(P<0.01)。ACU与ARH组相比,TGF-β1的mRNA水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。在ARH组,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠TGF-β1的mRNA水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。在ACU组,与Atg5flox/floxCD4+Cre-小鼠比较,Atg5flox/floxCD4+Cre+小鼠TGF-β1的mRNA水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。
在Atg5条件性敲除小鼠中,经过蛋白之间的相关性分析得到,TGF-β蛋白和α-SMA蛋表达量呈正相关(R=0.907,P<0.01)。
结论:
Atg5条件性基因敲除能明显改善哮喘动物模型气道重塑,其机制可能跟降低TGF-β信号通路蛋白表达有关。针刺能够改善Atg5条件性基因敲除动物气道重塑,其机制可能跟降低TGF-β信号通路蛋白表达有关。
四、TGF-β和Notch信号通路在人支气管上皮细胞的上皮-间质化发挥的作用
目的:
探讨TGF-β和Notch信号通路在人支气管上皮细胞的上皮-间质化发挥的作用
方法:
人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞,用TGF-β1干预72h,TGF-β1+GSI-Ⅻ组则是用GSI-Ⅻ(10μM)和TGF-β1(5ng/ml)干预72h,使用CCK-8检测细胞活力,EdU检测细胞增殖活性,使用细胞划痕和细胞迁移实验检测细胞的迁移功能,使用鬼笔环肽染色检测对细胞骨架的影响。采用WB检测对细胞蛋白E-cadherin、α-SMA和Notch通路蛋白的影响。
结果:
CCK8结果显示:TGF-β1和GSI-Ⅻ对BEAS-2B细胞活性并没有影响(P>0.05)。EdU检测结果显示,Con组,TGF-β1组和TGF-β1+GSI-Ⅻ组细胞增值率均在33%左右,并无差异(P>0.05)。TGF-β1处理后,细胞之间间隙增大,细胞排列不规则,细胞边缘不清晰;细胞骨架肌动蛋白增多;在细胞划痕实验中,TGF-β1促进了划痕的愈合(P<0.01);在细胞迁移实验中,TGF-β1促进了BEAS-2B细胞的迁移(P<0.01);TGF-β1导致E-cadherin蛋白表达降低,α-SMA蛋白表达升高(P<0.01);TGF-β1导致Notch通路蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01)。使用了GSI-Ⅻ后,抑制了TGF-β1导致的细胞划痕愈合(P<0.01);抑制了TGF-β1导致的细胞迁移(P<0.01);与TGF-β1组相比,使用了GSI-Ⅻ后,E-cadherin蛋白表达升高,α-SMA蛋白表达降低(P<0.01);与TGF-β1组相比,使用了GSI-Ⅻ后,Notch通路蛋白Hes-1蛋白的表达下降(P<0.01)。
结论:
TGF-β1促进了气道上皮的上皮-间质化转变,并且激活了Notch通路,但是,使用了Notch抑制剂后,抑制了TGF-β1介导的气道上皮的上皮-间质化转变。因此,Notch通路介导了TGF-β1诱导的气道上皮的上皮-间质化转变。