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研究背景:青光眼是世界范围内致盲的主要原因,其特征是视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）的丢失、视神经萎缩和视野缺损。除病理性眼压（intraocular pressure,IOP）升高是其主要的危险因素外,视网膜的缺血缺氧、兴奋性毒性、炎症反应和RGCs轴突的损伤等均是造成RGCs死亡不可忽视的病理机制。由于青光眼复杂而不明确的发病机制,研究人员和临床医生迫切希望探索新的治疗方法,以保护RGCs免受损伤,并减轻视神经损伤或促进轴突的再生。当视神经受到损伤后,视网膜中的星型胶质细胞和小胶质细胞被活化并产生大量炎性因子,而且损伤也会诱导视网膜细胞焦亡的发生,这都可能对RGCs造成进一步损伤。此外,视神经损伤后也会对RGCs轴突造成伤害。这可能是由于损伤诱导了视神经中胶质瘢痕的产生和炎性因子的释放,而且ROCK通路的激活会抑制轴突的再生。雷帕霉素是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,m TOR）信号通路的特异性抑制剂,不仅可以抑制神经胶质细胞活化,还能介导小GTPases和Rho的信号通路来调节肌动蛋白细胞骨架。虽然大量研究表明雷帕霉素对青光眼具有保护作用,但具体机制尚不清楚,仍需进一步研究。第一部分:雷帕霉素对三种实验动物模型的视网膜保护作用研究目的:青光眼是一组受多因素影响的眼部疾病,本实验的目的是为了探讨玻璃体腔注射雷帕霉素是否对多种青光眼模型具有保护作用。方法:本研究首先建立了视神经挤压（optic nerve crush,ONC）、视网膜缺血再灌注（ischemia-reperfusion,IR）和N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）视网膜兴奋性毒性的3种非眼压依赖型青光眼动物模型。然后分别在术后的第0天和第3天时往玻璃体腔内注射雷帕霉素,从而观察药物对青光眼模型的影响。再通过石蜡切片苏木素和伊红（haematoxylin and eosin,H＆E）染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）的实验方法来观察视网膜厚度和视网膜细胞损伤的变化。进而,运用视网膜平铺的技术和具有多种剪接形式的RNA结合蛋白（RNA binding protein with multiple splicing,RBPMS）免疫荧光染色对视网膜的RGCs进行特异性标记,来观察雷帕霉素对RGCs的影响。结果:正常组大鼠视网膜结构完整,层次清晰;正常Sprague-Dawley（SD）大鼠给予药物处理后,视网膜未见明显改变。但给予ONC、IR和NMDA损伤后,3组大鼠的视网膜均发生了明显的改变,具体表现为视网膜萎缩变薄、神经节细胞层（ganglion cell layer,GCL）细胞水肿、数量显著减少。而且,TUNEL染色结果显示在各损伤组视网膜中可见大量TUNEL阳性细胞。此外,与正常组对比,ONC、IR和NMDA损伤后视网膜中央、中间及周边的RGCs数量减少了50%左右。但是,给予雷帕霉素处理损伤组后,视网膜结构得到了一定程度的改善,萎缩程度减轻,而且TUNEL阳性细胞数量减少,全视网膜的RGCs存活率也显著提高。结论:玻璃体腔注射雷帕霉素不仅可以显著改善ONC、IR和NMDA对视网膜厚度的损伤,而且大大提高了RGCs的存活率。第二部分:雷帕霉素对ONC损伤后视网膜炎症的影响目的:视网膜炎症在RGCs损伤过程中起着至关重要的作用。在第一部分内容中已证明雷帕霉素对ONC损伤后的RGCs具有保护作用,本实验进一步探究了雷帕霉素对RGCs保护的潜在机制是否与胶质细胞活化和细胞焦亡有关。方法:本实验建立了ONC模型,并将大鼠随机分成四组,分别是对照+溶剂（Con+Veh）组、对照+雷帕霉素（Con+RAPA）组、ONC+溶剂（ONC+Veh）组和ONC+雷帕霉素（ONC+RAPA）组。首先运用蛋白免疫印迹的方法检测了各组视网膜中RBPMS、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acid protein,GFAP）、离子钙接头蛋白（ionized calcium binding adapter molecule 1,IBA1）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,i NOS）的蛋白含量。我们还通过免疫荧光的方法观察了视网膜中星型胶质细胞和小胶质细胞的形态学变化。而且,进一步检测了视网膜中焦亡相关蛋白和免疫荧光的表达变化。结果:与Con+Veh组对比,视神经损伤后RBPMS的蛋白表达含量显著下降,而GFAP、IBA1和i NOS的蛋白表达含量显著升高。而且在视网膜中星型胶质细胞显著活化,胞体增大,分支增多且从GCL跨越到外核层（outer nuclear layer,ONL）;小胶质细胞数量也明显增多,且主要聚集在GCL。另一方面,与焦亡相关的炎性小体活化和炎性因子显著增加。与未给药的损伤组相比,给予雷帕霉素治疗后胶质细胞活化明显减弱,i NOS的蛋白含量显著降低,而且显著抑制了视网膜焦亡的发生。结论:雷帕霉素可以保护RGCs免受视神经挤压损伤,一方面可能是因为减弱了ONC诱导的星型胶质细胞和小胶质细胞的活化,另一方面可能抑制了焦亡小体的激活和炎性因子的释放。第三部分:雷帕霉素保护RGCs轴突免受ONC损伤的研究目的:视神经受到损伤后不仅会诱导RGCs的继发性丢失,而且会导致RGCs轴突的损伤。本研究的目的是探究雷帕霉素是否对视神经损伤后的轴突具有保护作用以及其潜在的机制。方法:我们首先建立了ONC模型,按照第二部分的方法将大鼠随机分成四组。然后,采用免疫荧光和透射电镜的方法来观察视神经纵切面和横切面整体和局部的结构变化,同时运用霍乱毒素B亚基（cholera toxin B subunit,CTB）特异性顺行标记了轴突。为进一步探索可能存在的机制,我们一方面通过免疫荧光技术观察星型胶质细胞活化情况;另一方面,运用蛋白印迹检查了m TOR/Rho激酶（Rho-associated kinase,ROCK）通路中蛋白的表达。结果:与Con+Veh组对比,在视神经夹持部位神经丝的荧光表达减弱,而且病灶附近轴突中神经丝200（neurofilament 200,NF200）、磷酸化的神经丝（SMI-31）和非磷酸化的神经丝（SMI-32）荧光紊乱,出现大量空洞及回缩球,细胞核也杂乱无章。透射电镜的结构也显示轴突数量显著降低、髓鞘疏松甚至脱失。CTB结果显示从损伤灶往大脑方向几乎未见CTB阳性的轴突。而且,损伤附近星型胶质细胞明显活化,形态变得杂乱无章。视神经中p-m TOR和ROCK蛋白在损伤后显著增加。给予玻璃体腔注射雷帕霉素后,损伤灶周边的神经丝得到了明显的改善,轴突数量也显著升高。视神经中的胶质细胞活化和炎性因子的释放也受到了抑制。而且,ROCK1和ROCK2蛋白表达量也显著减少,但生长相关蛋白43（growth-associated protein-43,GAP-43）在给予药物处理后显著升高。结论:雷帕霉素可以保护RGCs轴突免受损伤,其潜在的机制可能是因为雷帕霉素一方面抑制了星型胶质细胞的瘢痕化和相关炎症损伤,另一方面可能是因为抑制了ROCK通路的活化,促进了轴突的再生。