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研究背景:Howel-Evans综合症,又称为掌跖角化病合并食管癌(tylosis with oesophageal cancer,TOC),是一种常染色体显性遗传病,以手足掌跖部位的皮肤局部增厚为特征,并且一生中发生食管鳞状细胞癌的风险较高。在一个大的家系中,65岁及以上年龄的患者患食管鳞癌的概率为95%。目前该病在人群中的患病率低于百万分之一。患者可出现掌跖部位角化,口腔粘膜白斑,以及食管黏膜小的(2~5毫米)、白色的、点状多倍体病变。食管癌的症状主要包括吞咽困难,食欲不振,厌食和体重减轻,但在疾病早期并没有明显的症状,因此提出早发现早诊断的重要性。与掌跖角化病相关的食管癌通常在中到晚年(55岁以后)出现,进展不早于散发的食管鳞状细胞癌。该病皮肤特征完全外显,通常在7~8岁时出现,最晚青春期时会开始表现出来。截至目前为止,国外有报道发现该病致病基因位于17q25.1上的RHBDF2基因,诊断为掌跖角化病合并食管癌。RHBDF2(Rhomboid family member 2)基因可以编码非活性菱形蛋白2(inactive rhomboid-like protein2,i Rhom2),这种蛋白可以对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的脱落起作用。RHBDF2基因突变可能使IRHOM2蛋白的结构及定位发生变化,进而使EGFR信号通路发生异常改变,从而导致了食管癌的发生。本病以阳性家族病史为基础,临床特征包括皮肤掌跖部位增厚角化,食管损伤,以及RHBDF2基因突变的遗传学分析。本研究旨在找到该病中国患病家系位于RHBDF2基因上的突变位点,检测iRhom2蛋白在患者足底及食管黏膜组织中的表达变化。实验材料与方法:1、研究对象:中国医科大学附属第一医院皮肤科门诊收集1个该病家系,来自于辽宁省,包括4代人,21个家系成员,其中11人为确诊患该病患者,无近亲结婚史,妊娠史正常,完善临床检查。经患者和家属知情同意后,采集家系成员血样,足底及食管黏膜组织样本,样本保存于-80℃超低温冰箱。2、实验材料:EDTA、无水乙醇、琼脂糖、蛋白酶K、5×TBE电泳缓冲液、GoldviewⅠ、DL2000 DNA Marker、PCR相关试剂等。3、实验方法:(1)采集家系成员血样,提取DNA,对RHBDF2基因的19个外显子进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,从而获取目标靶基因。(2)对目标靶基因进行直接测序,将扩增序列进行分析,与正常人类及人类基因组库的基因进行对比,从而找出基因突变的靶点。(3)iRhom2蛋白表达分析:利用免疫荧光和免疫组化分析iRhom2蛋白分别在患者足底及食管粘膜组织中的表达变化情况。实验结果:1、候选致病基因RHBDF2基因外显子PCR扩增及基因组DNA测序:通过DNA直接测序法证实该家系RHBDF2基因第6号外显子检测出一个错义突变位点,位于cDNA第589位的碱基,该处碱基由胞嘧啶变成腺嘌呤,即c.589C>A(p.R197S)。2、iRhom2蛋白表达分析:免疫组化实验结果表明iRhom2蛋白在该病患者食管黏膜细胞质中高表达。免疫荧光结果表明iRhom2蛋白在足底组织细胞质和细胞膜中均有表达,在正常人以细胞膜表达为主,而在患者中以细胞质表达为主,二者的亚细胞定位有明显差异。结论:1、该家系致病基因突变可能是RHBDF2杂合错义突变c.589C>A(p.R197S),且为国内外首次报道的新突变。2、该家系患者足底部位的iRhom2蛋白定位发生变化,由以细胞膜分布为主改变为细胞质分布为主。该家系患者食管黏膜部位细胞内iRhom2蛋白高表达。