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茶氨酸(又称N-乙基-γ-L-谷氨酰胺,简称Theanine)是茶中特有的氨基酸,不仅影响着茶的滋味,而且还具有重要的生物活性,如降血压、抗癌、增强抗肿瘤药物的疗效、保护神经、镇静安神、提高学习和记忆能力和抗疲劳的功效。本试验克隆了茶氨酸合成相关的酶基因,同时建立了“新高”梨的增殖体系,为人工培育茶氨酸梨提供研究基础。1、本试验利用cDNA末端快速扩增技术扩增茶氨酸合成相关酶基因的3’端,设定了如下扩增体系:模板cDNA100ng,10×Buffer(Mg2+p lus)5μl,2.5mmol/L dNTPs8μl,10μmol/L特异性引物GSP47-1(第二轮为GSP47-2)1μl、10μmol/L接头引物UPM (第二轮为NUP)1μl,L ATaq DNA聚合酶2.5U,总体积50μl。扩增程序为:94℃3min;94℃30s;70℃45s;72℃80s,14个循环,-0.5℃/cycle;94℃30s;63℃45s;72℃80s,25个循环;72℃延伸10min。在此基础上克隆出长度约为2.4kb的序列。将该序列与GenBank上已知序列比对,发现与葡萄的谷氨酸氨连接酶的核苷酸序列的相似度达81%。2、反向PCR技术(IPCR)是对已知序列DNA的两侧未知序列进行扩增和研究的方法。本试验应用IPCR方法克隆茶氨酸合成相关酶基因的启动子序列:即20μl反应液中包含1μg模板、5U限制性内切酶Bsp1407,2μl10×T buffer,2μl0.1%BSA;酶切产物环化自连体系:50μl体系中0.5μg单酶切基因组DNA,5μl10×T4连接缓冲液、5U T4DNA连接酶,22℃连接过夜;IPCR反应体系:50μl体系中约50ng环化自连接产物、2.5μl10×PCR Buffer、25mmol/L Mg2+5μl、10mmol/L dNTPs1μl,10μmol/L引物对(第一轮1S1-1S2,第二轮2S1-2S2)各2ul、1U Taq聚合酶。IPCR扩增程式为:94℃3min,94℃l min,56℃1min,72℃1min,循环29次;72℃延伸7min。利用建立的IPCR技术克隆出茶氨酸合成酶基因5’上游长度为171bp的启动子序列,且该序列含有TATA-box,该元件对基因转录的正确起始起着重要的作用。3、本试验以‘新高’梨芽为外植体,研究了不同浓度植物生长调节剂对其离体增殖的影响。结果表明适宜‘新高’梨离体增殖的培养基为1/2MS+6-BA0.5mg.L-1+IBA0.2mg.L-1+GA30.5mg.L-1,在此培养基上平均增殖系数达到3.3。