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目的:本研究拟探讨老鼠簕生物碱A（Acanthus ilicifolius alkaloid A,HBOA）能否缓解高脂饮食（High-fat diet,HFD）所诱导的大鼠非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的损伤作用。此外,并进一步探讨了HBOA是否通过调控NAFLD大鼠肝脂质生成相关因子及内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ERS）信号通路基因与蛋白表达,继而发挥抗NAFLD的作用机理。方法:60只Sprague Dawley雄性大鼠随机分成两大组:Ι组大鼠（10只）,喂养基础饲料;ΙΙ组大鼠（50只）,喂养高脂饲料以复制NAFLD模型。持续饲养8周后,按照NAFLD模型判断的金标准,随机挑出2只Ι组大鼠和5只ΙΙ组大鼠行肝脏病理学分析。确定大鼠NAFLD建模成功后,再将ΙΙ组大鼠随机分成模型组、HBOA高剂量组、HBOA中剂量组、HBOA低剂量组、水飞蓟宾组,Ι组大鼠作为正常对照组,每组8只。从第9周起,除了继续给予高脂饲料外,水飞蓟宾组大鼠则灌胃注入水飞蓟宾26.25 mg/kg/d,HBOA低、中及高剂量组各自灌胃给予HBOA 25、50、100 mg/kg/d,而正常对照组与模型组大鼠则灌胃相等体积的0.6%CMC-Na,直至12周结束。大鼠过夜禁食10 h,不禁水,次日早上采集且保存血清和肝脏样本,用于后续的检测分析。取血清标本,使用全自动生化分析仪测定AST、ALT、TP、ALB、TG、TC、HDL-C及LDL-C的水平,选用试剂盒检测FFA含量。取肝脏标本,选用试剂盒检测SOD、MDA、GSH、GSH-Px及MPO的含量。另制备肝脏切片,通过H＆E染色和Masson染色来评价肝脏病理学结构变化和胶原沉积;采取饱和油红O染色和TUNEL染色观察肝细胞脂肪脂滴沉积和肝细胞凋亡情况;利用免疫组织化学法观察肝组织中PERK、EIF2α、ATF6、GRP78及CHOP蛋白表达。此外,选择RT-PCR法与Western blot法检测内质网应激信号通路和脂质合成相关因子的基因与蛋白表达,以及炎症与凋亡的相关蛋白表达。结果:1.HBOA对NAFLD大鼠肝损伤有保护作用结果显示,模型组血清中AST、ALT活性明显升高,A/G比值倒置;经HBOA治疗后,能明显降低血清中AST、ALT活性,恢复A/G比值。另外,H＆E与Masson染色表明,正常对照组肝细胞无显著脂肪变性,结构序列清晰完整,未见病变区域,仅有微量胶原沉积于血管壁上;模型组肝细胞呈现大面积脂肪变性,脂肪空泡明显,胞质疏松且结构排列紊乱,汇管区有少许嗜酸性坏死和炎症细胞浸润,胶原沉积显著增多;然而,HBOA治疗组能明显减轻肝脏病变的程度。这些结果提示,HBOA可通过减轻NAFLD大鼠肝细胞损伤和胶原沉积及降低血清酶活性,从而改善肝脏病变程度。2.HBOA缓解NAFLD大鼠的氧化应激及脂质过氧化与正常对照组相比,模型组肝组织中GSH-Px、SOD、GSH活力显著降低,MDA含量显著升高;但通过HBOA干预后,能显著逆转这些水平的异常变化。上述结果表明,HBOA对NAFLD大鼠治疗作用可能与其抑制氧化应激、减轻脂质过氧化及提升抗氧化酶活力有关。3.HBOA减轻NAFLD大鼠炎症反应与正常对照组相比,模型组肝组织中MPO含量显著升高,经过HBOA治疗可显著降低其含量。WB结果还显示,与正常对照组相比,模型组肝组织中NF-κBp65、IκBα蛋白的磷酸化水平显著上调。但经HBOA治疗后,能显著下调肝组织中NF-κBp65、IκBα蛋白的磷酸化水平。以上结果指出,HBOA可影响HFD所致的NF-κB信号通路中关键因子的激活,从而降低细胞炎性反应。4.HBOA缓解NAFLD大鼠肝细胞凋亡TUNEL染色结果表明,与正常对照组相比,模型组肝组织中呈现出大量的凋亡细胞;与模型组相比,HBOA干预组中细胞凋亡的数量有一定程度的降低。此外,WB结果还显示,模型组肝组织中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-12的表达明显上调,抑凋亡蛋白Bcl-2的表达明显下调;给予HBOA治疗后,可明显逆转这些蛋白的异常表达。以上结果指出,HBOA对HFD诱导的NAFLD大鼠肝细胞凋亡有较强的抑制作用。5.HBOA降低NAFLD大鼠肝脂质沉积血清脂质水平结果表明,与正常对照组相比,模型组血清中FFA、TG、TC、LDL-C的含量显著增多,HDL-C含量显著减少;与模型组相比,HBOA治疗组可显著逆转血脂水平的紊乱。油红O染色结果表明,正常对照组的肝细胞结构序列中几乎无红色脂肪滴呈现,而模型组肝细胞中沉积大量的红色脂肪滴,形状不一。给予HBOA治疗后,能显著降低肝细胞中红色脂肪滴的沉积。以上结果指出,HBOA能改善HFD所致的NAFLD大鼠血清脂质水平紊乱及有效降低肝脏脂质累积。6.HBOA调控NAFLD大鼠肝脂质生成相关基因和蛋白的表达RT-PCR实验结果表明,与正常对照组相比,模型组肝组织中SREBP-1c、FASN、LXRαm RNA表达明显上调,AMPK m RNA表达明显下调;给予HBOA治疗后,能明显逆转肝组织中脂质合成基因的异常表达。此外,WB结果还显示,模型组肝组织中SREBP-1c、ACC1、FASN、LXRα蛋白的表达水平明显上调,AMPK蛋白的磷酸化水平明显下调;给予HBOA治疗后,可显著逆转这些脂质合成蛋白的异常表达。以上结果表明了HBOA可通过调控脂质生成相关基因与蛋白的表达,从而降低NAFLD大鼠肝脂质沉积。7.HBOA抑制NAFLD大鼠ERS信号通路的激活RT-PCR与WB实验结果表明,与正常对照组相比,模型组肝组织中GRP78基因和蛋白表达水平明显上调,经HBOA处理后,能显著下调GRP78的异常表达。进一步的实验还显示,长期的HFD能使大鼠肝组织中PERK、EIF2α、IRE1α、JNK蛋白的磷酸化水平以及ATF6、CHOP、ATF4、XBP-1蛋白的表达水平显著上调,经HBOA干预后,能显著抑制这些蛋白的异常表达。另外,与正常对照组相比,模型组大鼠肝组织中PERK、EIF2α、CHOP、IRE1α、ATF6 m RNA表达水平也明显上调,但通过HBOA治疗后,则明显抑制这些基因的异常表达。免疫组织化学法表明,正常对照组的肝组织切片显示GRP78、PERK、EIF2α、CHOP、ATF6蛋白仅微量表达,在长期HFD的影响下,GRP78、PERK、EIF2α、CHOP、ATF6的表达显著增多,而HBOA治疗组能明显降低这些蛋白的异常表达。上述实验结果指出,HBOA可能通过抑制ERS信号通路主要蛋白的激活来缓解HFD所致NAFLD大鼠肝脏损伤。结论:本研究结果阐明了HBOA能有效减轻HFD诱导的NAFLD大鼠肝细胞损伤和肝脂肪细胞变性,这可能归咎于HBOA能抑制氧化应激,提升抗氧化防御能力,缓解炎症反应及降低脂肪滴生成有关。另外,研究还证明了HBOA能通过抑制ERS信号通路和调节脂质合成相关基因和蛋白的表达,从而显著改善HFD诱导的大鼠肝脂质代谢紊乱和肝细胞凋亡。