前言烟草危害是当今世界最大公共卫生问题之一。吸烟已被界定为全球可预防死亡的首要死因。随着医疗技术的进步,全世界每年有6000万吸烟者接受大型手术,吸烟是围手术期并发症的独立危险因素,戒烟可显著降低围术期心血管、呼吸和创伤相关并发症的发生率。因此,所有择期手术患者术前均需戒烟,尼古丁依赖-戒断和术后疼痛之间的关系是近年来麻醉学研究广为关注的问题。尽管不断积累的研究表明,长期戒烟可减轻慢性疼痛患者疼痛现状并改善预后,然而在尼古丁戒断早期实验性疼痛反应增加,表现为痛觉过敏,且疼痛强度评分与尼古丁戒断症状呈正相关,这在热板法、甩尾法和足底刺激法致动物疼痛模型中已被反复证实。后期临床研究也表明,与非吸烟者相比,吸烟者在戒烟早期对实验室疼痛的敏感性更高,并且疼痛强度评分也与尼古丁戒断症状呈正相关。围术期戒烟则可增加术后疼痛评分和阿片类镇痛药物的用量,导致术后呼吸抑制、恶心呕吐、皮肤瘙痒等阿片类镇痛药物相关副作用发生率增加。因此,制定吸烟患者术后个体化镇痛方案是亟待解决的问题。近年来,基于目前已明确的尼古丁依赖-戒断致痛觉过敏的机制,改进了吸烟患者围术期疼痛治疗措施,然而效果并不理想。因此,尚需进一步探讨尼古丁依赖-戒断痛觉过敏的可能机制,以便为吸烟患者提供理想的术后镇痛。目前公认参与疼痛反应的细胞除神经元外,还包括免疫细胞（如小胶质细胞,巨噬细胞和T细胞等）以及施旺细胞、卫星细胞,其中尤其是小胶质细胞,它先于其他细胞在损伤反应早期激活,小胶质细胞与神经元的相互作用对痛觉敏化的形成至关重要。大量研究表明活化的小胶质细胞可通过上调细胞表面受体的表达、分泌大量的炎性因子,进而激活疼痛相关信号通路参与神经性病理性疼痛、癌症相关疼痛和吗啡耐受致痛觉过敏发生和维持。既往动物研究发现,长期的尼古丁暴露和尼古丁戒断可引起小胶质细胞的激活,将米诺环素（小胶质细胞抑制剂）鞘内注射可通过抑制小胶质细胞激活改善尼古丁依赖-戒断痛觉过敏。因此得出结论,小胶质细胞激活同样参与了尼古丁戒断后痛觉过敏的形成。而后深入探讨小胶质细胞活化调控痛觉过敏的机制,证实了小胶质细胞P2X4受体（P2X4 receptor,P2X4R）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）和白细胞介素1 β（Interleukin-1 beta,IL-1β）在尼古丁依赖-戒断致痛觉过敏中的重要性。然而,关于尼古丁依赖或戒断对小胶质细胞活化及上述疼痛相关分子表达变化的影响及其机制尚不清楚,需进一步研究确定。干扰素调节因子8（interferon regulatory factor 8,IRF8）,亦称为干扰素共有序列结合蛋白,是一种核转录因子。在中枢神经系统中,IRF8仅在小胶质细胞中特异性表达,对小胶质细胞的活化和运动起着至关重要的作用。生理条件下,IRF8缺失可导致小胶质细胞形态发生异常、吞噬功能下降、离子钙接头蛋白1（Ionized calcium bindingadaptor molecule-1,IBA-1）的表达低。在病理情况下,IRF8 参与调控与小胶质细胞激活相关的基因表达,将其转化成反应性表型。IRF8基因敲除可改变小胶质细胞在不同外部刺激下的分子蛋白表达谱。动物模型研究表明,脊髓小胶质细胞IRF8表达上调参与小鼠反复冷应激模型中触觉异常疼痛的产生。在小鼠神经损伤模型中发现IRF8可通过IRF5增强P2X4R的表达,从而促进P38丝裂原激活蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK）的激活和小胶质细胞中BDNF的释放,促进神经性疼痛的发生和维持。正如前述,既往动物模型研究已经明确了小胶质细胞活化以及P2X4R-BDNF通路在慢性尼古丁依赖和尼古丁戒断中的重要作用,然而关于小胶质细胞活化及P2X4R表达上调的机制,目前尚不清楚。基于尼古丁依赖-戒断致痛觉过敏与神经病理性疼痛产生机制的相似之处,我们观察了 IRF8在尼古丁依赖-戒断致痛觉过敏形成中是否也发挥着重要作用,并进一步探讨其相关机制。本研究首先构建尼古丁依赖BV2小胶质细胞模型,观察尼古丁依赖对小胶质细胞活化的影响,进而通过基因干预技术探讨了 IRF8在其中的关键作用。而后进一步通过建立尼古丁依赖-戒断小鼠模型,观察脊髓背角IRF8的表达变化,并采用慢病毒鞘内注射技术,观察下调IRF8表达对尼古丁依赖-戒断小鼠热痛阈值和小胶质细胞活化及其P2X4R-BDNF通路影响。这将进一步阐明了尼古丁依赖-戒断致痛觉过敏的发生机制,为吸烟患者术后疼痛管理提供新的靶点和理论基础。第一部分慢性尼古丁暴露对BV2细胞活化的影响目的探讨慢性尼古丁暴露对BV2细胞活化的影响及IRF8在其中的作用。方法①体外培养BV2小胶质细胞,分别加入不同浓度的尼古丁（终浓度分别为0,10,50,100μmol/L）进行干预72h,ELISA法检测尼古丁依赖BV2细胞培养基上清中BDNF、IL-1β蛋白的表达,Western Blot检测尼古丁依赖BV2细胞中IRF8、P2X4R蛋白的表达。Real-time PCR检测尼古丁依赖BV2细胞中IRF8、P2X4R、BDNF、IL-1βmRNA的表达。②为进一步明确慢性尼古丁暴露对BV2细胞分泌BDNF、IL-1β的影响,实验分为五组,分别为对照组、ATP组、尼古丁低剂量+ATP组、尼古丁中剂量+ATP组、尼古丁高剂量+ATP组,其中ATP组、尼古丁低剂量+ATP组、尼古丁中剂量+ATP组、尼古丁高剂量+ATP组在慢性尼古丁暴露72h后,加入ATP（终浓度50μmol/L）刺激2h,ELISA法检测ATP刺激后尼古丁依赖BV2细胞培养基上清中BDNF、IL-1β蛋白的表达。③为进一步明确P2X4R在调控尼古丁依赖BV2细胞BDNF、IL-1β释放中的作用,实验分为六组,分别为对照组、5-BDBD组、ATP组、ATP+5-BDBD组、尼古丁预处理+ATP组、尼古丁预处理+ATP+5-BDBD组六组,分别用嘌呤受体激动剂ATP及拮抗剂5-BDBD（终浓度20μmol/L）进行干预,ELISA法检测尼古丁依赖BV2细胞培养基上清中BDNF、IL-1β蛋白的表达变化。④为进一步明确IRF8在调控P2X4R、BDNF、IL-β的表达中的作用,首先构建靶向IRF8基因的干扰或过表达慢病毒,其中IRF8shRNA设计三个干扰序列,筛选出干扰效率最高的序列作为后续实验的首选病毒。而后用IRF8基因干扰或过表达慢病毒感染BV2细胞,确定干扰或过表达效率。⑤BV2细胞被IRF8基因干扰或过表达慢病毒感染成功后,进行慢性尼古丁暴露72h,Western Blot检测尼古丁依赖BV2细胞中P2X4R蛋白的表达变化,Real-time PCR检测BDNF mRNA、IL-1βmRNA的表达变化。结果①Real-time PCR结果显示,慢性尼古丁暴露可剂量依赖性增加BV2细胞中 IRF8、P2X4R、BDNF mRNA 的表达,终浓度 50μmol/L 和100μmol/L 尼古丁显著上调IL-1βmRNA的表达（P＜0.05）,而10μmol/L尼古丁诱导IL-1β mRNA的表达有增加的趋势,但差距无统计学意义（P＞0.05）。Western Blot结果显示,慢性尼古丁暴露可剂量依赖性增加BV2细胞中P2X4R蛋白的表达,且终浓度50μmol/L和100μmol/L尼古丁可显著上调IRF8蛋白的表达（P＜0.05）,而10μmol/L尼古丁诱导IRF8蛋白表达增加的趋势不明显（P＞0.05）。ELISA结果显示,相比于对照组而言,终浓度10μmol/L和50μmol/L尼古丁没有诱导BDNF和IL-1β的分泌（P＞0.05）。即使100 μmol/L尼古丁也只促进少量BDNF的分泌（67.22±3.79 pg/mL vs.42.31±2.95 pg/mL）和 IL-1β（33.78±1.25 pg/mL vs.26.39± 1.03 pg/mL）（P＜0.05）。②相比于对照组而言,低、中、高剂量尼古丁+ATP组BV2细胞培养基上清中BDNF和IL-1β浓度均明显增加,且与尼古丁剂量呈剂量正相关性,其中高剂量尼古丁+ATP组培养基上清中BDNF和IL-1β的浓度分别比对照组增加3.1倍（159.56± 5.32 pg/mL和41.19±3.97 pg/mL）和2.4倍（64.37±1.93 pg/mL 和 26.32±1.03 pg/mL）（P＜0.05）。③相比于尼古丁预处理+ATP组而言,尼古丁预处理+ATP+5-BDBD组培养基上清中的BDNF和IL-1β的浓度分别降低了约52%和55%（P＜0.05）。④经过筛选确定IRF8shRNA2可作为后续感染细胞和动物实验的首选干扰慢病毒,慢病毒感染BV2细胞可成功的上调或上调IRF8表达;⑤下调IRF8基因表达可部分抑制尼古丁依赖BV2细胞中P2X4R蛋白的表达以及IL-1β mRNA和BDNF mRNA的合成,相反的,上调IRF8基因的表达可增加尼古丁依赖BV2细胞中P2X4R蛋白的表达以及IL-1βmRNA 和 BDNF mRNA 的合成。结论慢性尼古丁暴露可上调BV2细胞IRF8、P2X4R表达及BDNF、IL-1β的合成,并维持BV2细胞在适当刺激下释放高水平IL-1β和BDNF的能力。IRF8参与调控尼古丁依赖BV2细胞BDNF、IL-1β和P2X4R的表达。第二部分尼古丁依赖-戒断对小鼠痛阈及脊髓IRF8表达的影响目的观察尼古丁依赖-戒断小鼠疼痛行为学改变及脊髓IRF8表达变化。方法健康雄性C57BL/6小鼠40只,随机分为生理盐水对照组（Control组）和尼古丁依赖-戒断组（NTW组）,每组各20只。NTW组分别于每天的7:00,15:00,23:00分三次经左下腹皮下注射尼古丁9mg/（kg·d）,连续7天,Control组则注射等体积生理盐水,末次注射尼古丁或生理盐水后60min,两组小鼠均皮下注射美加明1mg/kg。观察记录所有小鼠注射美加明后30min内的戒断症状及评分,判断尼古丁依赖-戒断模型是否建立成功。采用Hargreaves热辐射方法,分别于造模前及注射美加明后第1,4,7,10,14天测定两组小鼠在热辐射刺激下出现缩爪反射的潜伏期（Thermal withdrawal latency,TWL）。每次完成TWL测定后,每组各取3只小鼠取脊髓腰膨大,Western Blot检测脊髓中IRF8表达。另外,在注射美加明后第7天完成TWL测定后,每组取5只小鼠心脏灌注后取脊髓腰膨大,免疫组化检测小鼠脊髓背角IRF8表达。结果①NTW组小鼠出现明显的戒断症状,戒断症状评分与既往报道的渗透微型泵慢性尼古丁输注致尼古丁戒断模型相似,故认为此种尼古丁依赖-戒断模型建立方法是简便可行的。②疼痛行为学测定结果显示尼古丁戒断后第1天开始出现TWL下降,至第7天降至峰值,随后逐渐升高,且TWL降低至少持续14天。③尼古丁依赖-戒断后脊髓IRF8表达增加,且IRF8表达水平与小鼠TWL变化趋势呈负相关。结论每天皮下分三次注射9mg/（kg·d）,连续7天,末次注射后60min皮下注射美加明1mg/kg,可以成功制作尼古丁依赖-戒断小鼠模型。脊髓背角中IRF8的表达增加与尼古丁依赖-戒断后痛觉过敏的产生和维持存在一定相关性。第三部分鞘内注射IRF8基因干扰慢病毒载体对小鼠尼古丁依赖-戒断痛觉过敏的影响及其可能机制目的观察鞘内注射IRF8基因干扰慢病毒载体对小鼠尼古丁依赖-戒断痛觉过敏的影响及其可能机制。方法成功建立尼古丁依赖-戒断模型的C57BL/6小鼠36只,随机分为三组,分别为:①生理盐水组（NS组）:造模成功24小时后鞘内注射生理盐水5μL,每天1次,共3天;②IRF8干扰慢病毒组（IRF8-RNAi-LV组）:造模成功24小时后鞘内注射IRF8shRNA慢病毒5μL,每天1次,共3天;③空载慢病毒组（NC-LV组）:造模成功24小时后鞘内注射干扰阴性对照慢病毒5μL,每天1次,共3天。Real-time PCR和Western blot法分别测定脊髓中IRF8mRNA和蛋白的表达,确定体内慢病毒干扰效率。末次鞘内注射24小时后每天同一时间点测定各组小鼠TWL值,连续7天。第7天最后一次TWL检测后,每组各取5只小鼠心脏灌注后取脊髓,免疫组化检测小鼠脊髓背角小胶质细胞标志物IBA-1表达,坚固性指数分析小胶质细胞活化程度。每组各取7只小鼠取脊髓,分别用Real-time PCR和Western blot法分别测定脊髓中P2RX4、BDNF mRNA和蛋白的表达。结果①鞘内注射IRF8基因干扰慢病毒载体可成功下调脊髓IRF8的表达;②末次鞘内注射后第4天TWL显著增加,且一直持续至末次鞘内注射后第7天;③鞘内注射IRF8shRNA慢病毒载可部分抑制小胶质细胞活化;④鞘内注射IRF8shRNA慢病毒可下调小鼠脊髓P2X4R、BDNF mRNA和蛋白的表达。结论鞘内注射IRF8shRNA慢病毒下调IRF8表达,能显著减轻尼古丁依赖-戒断诱导的痛觉过敏,其机制与抑制尼古丁依赖-戒断后脊髓背角小胶质细胞的激活及P2X4R及BDNF的表达相关。