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研究背景脑卒中是目前我国成人致残、致死的首位病因,也是全世界范围内致残、致死的主要疾病之一,其中缺血性脑卒中（ischemic stroke,IS）约占84.4%。急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke,AIS）最有效的治疗方法是通过静脉溶栓或血管内治疗及时再通闭塞的脑血管,恢复缺血脑组织的血流灌注。多项临床研究证实对符合适应症的AIS患者,在发病4.5小时内给予重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator,rt-PA）静脉溶栓能显著改善患者的临床预后。出血转化（hemorrhagic transformation,HT）是AIS患者rt-PA静脉溶栓治疗的主要并发症,也是限制rt-PA应用的主要原因之一;其中导致患者神经功能障碍加重的称为症状性颅内出血（symptomatic intracranial hemorrhage,sICH）,发生率约2-7%,85-90%发生在静脉溶栓后24小时内。AIS患者rt-PA静脉溶栓后发生HT的机制复杂多样,主要包括再灌注损伤、血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）破坏以及rt-PA相关血凝异常等。同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）是一种非必需的含硫氨基酸,主要由蛋氨酸代谢产生。血液中Hcy的水平受年龄、性别、遗传因素、营养状态、生活方式、某些药物及疾病等多种因素影响,正常水平一般为5-15 μmol/L;超过15μmol/L则称为高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia,HHcy）,在我国人群中的发生率约为27.5%。1969年,McCully等学者首次报道Hcy可导致动脉粥样硬化,后续研究发现Hcy还与多种中枢神经系统（central nervous system,CNS）疾病相关,包括多种脑血管病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病以及偏头痛等。对脑血管病而言,Hcy不仅是IS可干预的危险因素之一,而且可能还参与脑出血、颅内动脉瘤及脑小血管病等的发生和发展。此外,也有研究发现血Hcy水平可能与AIS患者的临床预后相关。然而,关于血清Hcy水平与AIS患者rt-PA静脉溶栓后HT及预后的关系研究较少。因此,本研究的第一和第二部分分别通过回顾性收集接受rt-PA静脉溶栓治疗的AIS患者的资料,分析血清Hcy水平与AIS患者rt-PA静脉溶栓后HT以及功能预后的关系。BBB破坏是AIS患者rt-PA静脉溶栓后HT及预后不良的重要机制之一,目前尚无研究关注血清Hcy水平轻度升高时对AIS患者rt-PA静脉溶栓后BBB的影响。因此,本研究的第三部分采用小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd.3）作为BBB的体外模型,通过分析30μmol/L Hcy在体外缺血再灌注模型中对氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/re-oxygenation,OGD/R）联合 rt-PA 干预的 bEnd.3细胞通透性的影响及机制,探讨血清Hcy增加AIS患者rt-PA静脉溶栓后HT和预后不良风险的机制。第一部分血清Hcy与AIS患者rt-PA静脉溶栓后出血转化的相关性分析研究目的关于血清Hcy水平与AIS患者rt-PA静脉溶栓后HT的相关研究较少,且结论不一。该部分研究目的是探讨血清Hcy水平是否与AIS患者rt-PA静脉溶栓后24小时内发生HT相关。研究方法回顾性收集236例发病4.5小时内接受rt-PA静脉溶栓治疗的AIS患者的资料,包括:年龄、性别;与AIS有关的合并疾病;吸烟、饮酒史;既往用药史;静脉溶栓相关资料-从入院到开始静脉溶栓的时间（door-to-needletime,DNT）、从发病到开始静脉溶栓的时间（onset-to-needle time,ONT）、静脉溶栓前血压及美国国立卫生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS）评分、静脉溶栓后24小时NIHSS评分;血液化验结果（包括血清Hcy水平）;颅脑CT/MRI和颅内外血管检查结果;常规心电图、心脏超声、动态心电图等心脏相关检查结果及TOAST分型。对研究对象的影像资料进行回顾性分析以判断在静脉溶栓后24小时内是否发生HT;导致NIHSS评分增加≥4分或致死的HT判定为sICH。分别根据研究对象在rt-PA静脉溶栓后24小时内是否发生HT和sICH分为两组（HT组和非HT组,sICH组和非sICH组）,比较上述资料是否存在组间差异。采用Spearman相关分析探讨血清Hcy水平与静脉溶栓前NIHSS评分的相关性;多因素Logistic回归分析血清Hcy水平是否与AIS患者静脉溶栓后24小时内发生HT的风险独立相关并获得比值比（odds ratio,OR）和95%可信区间（confidence interval,CI）。采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）方法计算曲线下面积（area under the curve,AUC）评价血清Hcy水平对AIS患者静脉溶栓后24小时内发生HT的预测能力,并根据约登指数获得预测24小时内发生HT的最佳血清Hcy分界值。所有的统计分析采用SPSS 25.0完成,差异的显著性设定为P＜0.05。结果1.全部研究对象中男性共169例（71.6%）,年龄32.0-88.0（中位数65.0）岁,大面积脑梗死23例（9.7%）;28例（11.9%）在静脉溶栓后24小时内发生HT,其中 7例（3.0%）发生 sICH。血清 Hcy 水平4.45-67.71 中位数 12.05)μmol/L,静脉溶栓前NIHSS评分0-28.0（中位数5.0）分。TOAST分型各亚型的所占比例分别为:大动脉粥样硬化型（Large-artery atherosclerosis,LAA）49.2%、心源性栓塞（cardioembolism,CE）10.6%、小动脉闭塞型（small artery occlusion,SAO）32.2%、其他明确病因型（stroke of other determined etiology,SOE）1.3%和不明原因型（stroke of undetermined etiology,SUE）6.8%。血清 Hcy 水平与静脉溶栓前NIHSS评分无明显相关。2.HT组患者的血清Hcy水平（13.00 vs.11.70μmol/L）、静脉溶栓前NIHSS评分（9.0 vs.5.0）及大面积脑梗死的比例（21.4%vs.8.2%）均显著高于非HT组患者,而TOAST分型中SAO的比例明显低于非HT组患者（7.1%vs.35.6%）。血清 Hcy 水平（OR=1.103,95%=1.021-1.191,P=0.013）是 AIS 患者 rt-PA 静脉溶栓后24小时内发生HT的独立危险因素。3.SICH组患者的血清Hcy水平（15.19 vs.11.73 μmol/L）、凝血酶原时间（13.3 vs.12.1秒）、静脉溶栓前NIHSS评分（15.0 vs.5.0）、大面积脑梗死的比例（57.1%vs.8.3%）及TOAST分型中CE的比例（42.9%vs.9.6%）均显著高于非sICH组患者。4.ROC曲线显示血清Hcy水平可预测AIS患者rt-PA静脉溶栓后24小时内发生 HT 的风险（P=0.025）,但预测能力一般（AUC=0.630,95%CI=0.530-0.730）;血清Hcy水平预测AIS患者rt-PA静脉溶栓后24小时内发生HT的最佳分界值是11.88μmol/L,其灵敏性为71.4%,特异性为51.9%。结论1.AIS患者rt-PA静脉溶栓后24小时内HT的发生率为11.9%,sICH的发生率为3.0%;2.Rt-PA静脉溶栓后24小时内发生HT的AIS患者血清Hcy水平明显高于未发生HT者;发生sICH的患者血清Hcy水平明显高于未发生sICH者;3.血清Hcy水平是AIS患者rt-PA静脉溶栓后24小时内发生HT的独立危险因素,且可预测AIS患者rt-PA静脉溶栓后24小时内发生HT的风险。第二部分血清Hcy与AIS患者rt-PA静脉溶栓后预后的相关性分析研究目的目前关于血Hcy水平与AIS患者预后的研究结论不一。Rt-PA静脉溶栓可显著改善AIS患者的临床结局。该部分研究目的是探讨血清Hcy水平是否与AIS患者rt-PA静脉溶栓后3个月的功能预后相关。研究方法回顾性收集184例发病4.5小时内接受rt-PA静脉溶栓且完成3个月随访的AIS患者的资料,包括:年龄、性别;与AIS有关的合并疾病;吸烟、饮酒史;静脉溶栓相关资料-静脉溶栓前及静脉溶栓后24小时NIHSS评分、DNT、ONT;血液化验结果（包括血清Hcy水平）;TOAST分型以及发病90±7天的改良Rankin量表评分（modified Rankin Scale,mRS）。根据研究对象发病3个月时的mRS评分分为两组:预后良好（0-2分）和预后不良组（3-6分）,比较上述资料是否存在组间差异。采用Spearman相关分析探讨血清Hcy水平与静脉溶栓前NIHSS评分之间的相关性;多因素Logistic回归分析血清Hcy水平是否与AIS患者静脉溶栓后3个月预后不良的风险独立相关;采用ROC方法计算AUC评价血清Hcy水平对AIS患者静脉溶栓后3个月预后不良的预测能力,并获得预测3个月预后不良的最佳血清Hcy分界值。所有的统计分析采用SPSS 25.0完成,差异的显著性设定为P＜0.05。结果1.全部研究对象中男性共140例（76.1%）,年龄32.0-87.0（中位数65.0）岁;3个月时预后良好者128例（69.6%）,预后不良者56例（30.4%）,其中包括12例（6.5%）死亡患者。静脉溶栓前和静脉溶栓后24小时的NIHSS评分分别为0-28.0（中位数5.0）和0-25.0（中位数3.0）分;血清Hcy水平4.45-67.71（中位数12.30）μmol/L;TOAST分型中各亚型所占比例分别为:LAA47.8%,CE 12.5%,SAO 32.1%,SOE 1.6%和 SUE 6.0%。血清 Hcy 水平与静脉溶栓前 NIHSS评分无明显相关。2.静脉溶栓后3个月预后不良的AIS患者血清Hcy水平（12.74 vs.11.98μmol/L）,静脉溶栓前（12.0 vs.4.0）和静脉溶栓后24小时NIHSS评分（11.0 vs.2.0）,合并高血压（71.4%vs.54.7%）、冠心病（30.4%vs.10.9%）、心房颤动（28.6%vs.9.4%）的比例以及TOAST分型中CE的比例（26.8%vs.6.3%）均明显高于预后良好者,而SAO的比例明显低于预后良好者（17.9%vs.38.3%）。3.多因素Logistic回归分析显示血清Hcy水平是AIS患者静脉溶栓后3个月预后不良的独立危险因素（将静脉溶栓前NIHSS评分纳入分析:OR=1.109,95%CI=1.018-1.207,P=0.017;将静脉溶栓后24小时NIHSS评分纳入分析:OR=1.212,95%CI=1.039-1.413,P=0.014）。4.ROC曲线显示血清Hcy水平可预测AIS患者静脉溶栓后3个月预后不良的风险（P=0.029）,但预测能力一般（AUC=0.601,95%CI=0.514-0.688）;血清Hcy水平预测AIS患者rt-PA静脉溶栓后3个月预后不良的最佳分界值是12.05μmol/L,其灵敏性为64.3%,特异性为50.8%。结论1.AIS患者静脉溶栓后3个月预后不良的发生率为30.4%;2.Rt-PA静脉溶栓后3个月预后不良的AIS患者血清Hcy水平明显高于预后良好者;3.血清Hcy水平是AIS患者rt-PA静脉溶栓后3个月预后不良的独立危险因素,且可预测这类患者3个月预后不良的风险。第三部分血清Hcy增加AIS患者rt-PA静脉溶栓后出血转化和预后不良风险的机制研究研究目的BBB功能障碍是AIS患者rt-PA静脉溶栓后HT和预后不良的重要机制之一。该部分研究目的是探讨血清Hcy增加AIS患者rt-PA静脉溶栓后出血转化和预后不良风险的机制。研究方法采用bEnd.3细胞作为BBB的体外模型,给予细胞OGD/R干预建立缺血再灌注体外模型。在第一部分实验中,根据干预措施的不同（30μmol/LHcy、OGD/R、20μg/mLrt-PA）,将细胞分为对照组、OGD/R 组、Hcy+OGD/R 组、OGD/R+rt-PA组及Hcy+O GD/R+rt-PA组。在复氧24小时后采用Transwell小室检测各组细胞对荧光素钠（sodium fluorescein,NaF）的通透性;western blot检测各组细胞occludin、claudin-5、基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase,MMP-9）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK）1/2 及磷酸化ERK1/2（phosphorylated-ERK1/2,p-ERK1/2）（Thr202/Tyr204）的蛋白水平;实时荧光定量逆转录 PCR（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测各组细胞MMP-9的mRNA水平。在第二部分实验中,根据干预措施的不同（30 μmol/L Hcy、DMSO、10 μmol/L U0126、OGD/R、20 μg/mL rt-PA）,将细胞分为 OGD/R+rt-PA 组、Hcy+OGD/R+rt-PA 组、Hcy+DMSO+OGD/R+rt-PA 组 及Hcy+U0126+OGD/R+rt-PA组。同样在复氧24小时后进行上述指标的检测。实验数据使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。采用单因素方差分析,然后通过Tukey Post Hoc两两比较分析各组细胞对NaF的通透性、蛋白和mRNA水平的差异,差异的显著性设定为P＜0.05。结果1.与对照组相比,OGD 4小时导致bEnd.3细胞在复氧24小时对NaF的通透性增加49.6%,occludin和claudin-5的蛋白水平明显下降;30μmol/LHcy进一步增加OGD 4小时干预的细胞在复氧24小时对NaF的通透性至171.2%,并进一步降低细胞occludin的蛋白水平,但不改变claudin-5的蛋白水平;rt-PA导致OGD 4小时干预的细胞在复氧24小时对NaF的通透性进一步增加至191.8%,occludin和claudin-5的蛋白水平进一步降低;Hcy+OGD/R+rt-PA组细胞在复氧24小时对NaF的通透性（254.7%）显著高于Hcy+OGD/R及OGD/R+rt-PA组,且occludin和claudin-5的蛋白水平均显著低于Hcy+OGD/R及OGD/R+rt-PA组。2.与对照组相比,OGD 4小时导致bEnd.3细胞在复氧24小时ERK的磷酸化水平及MMP-9的蛋白和mRNA水平均显著升高;30 μmol/L Hcy和rt-PA分别导致OGD 4小时干预的细胞内ERK信号传导通路的活化水平及MMP-9的表达水平进一步升高;Hcy+O GD/R+rt-PA组细胞ERK信号传导通路的活化水平及MMP-9的表达水平最高,明显高于Hcy+OGD/R组及OGD/R+rt-PA组。3.U0126可通过抑制ERK信号传导通路,减轻30 μmol/L Hcy对OGD/R+rt-PA干预的细胞MMP-9表达水平、occludin和claudin-5蛋白水平及旁细胞通透性的影响。结论1.在体外缺血再灌注模型中,30 μmol/L Hcy可加剧rt-PA对bEnd.3细胞旁细胞通透性的影响;2.在体外缺血再灌注模型中,30μmol/LHcy可激活rt-PA干预的bEnd.3细胞内ERK信号传导通路,进而上调MMP-9的表达水平、加剧细胞紧密连接和旁细胞屏障功能的破坏。