研究背景和目的:肿瘤干细胞（cancer stem cells, CSCs）是恶性肿瘤组织中发育等级较高,分化程度较低的一群细胞。肿瘤干细胞也被称作肿瘤起始细胞（tumor initiating cells, TICs）,具有自我更新、多向分化及高致瘤性等特点,与肿瘤的发生、耐药、抗辐射及复发转移有关。Bonnet等首先在人类急性粒细胞白血病研究中发现肿瘤干细胞的存在,至今已在多种人类肿瘤中分离出肿瘤干细胞,包括乳腺癌、胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌以及肺癌。最初分离肺癌干细胞（lung cancer stem cell,LCSCs）的方法是建立在细支气管肺泡管交界处的正常肺部成体干细胞研究基础上的,对它们功能的深入研究及发现特异性膜抗原标志物Sca及CD34的表达为分离肺癌干细胞提供了大量参考。Kim等于2005年在小鼠支气管肺泡交界处分离出一群Sca+/CD34+双阳性细胞,并发现这群细胞在k-ras癌基因激活的情况下,会导致小鼠肺腺癌的发生,此研究是肺癌干细胞研究的里程碑。后来,Eramo等从肺癌病人组织标本成功分离共表达CD133+/ EpCAM+的双阳性细胞,经鉴定被定义为人类肺癌干细胞。此外,还有其他研究者不通过表面标志物的方法,而利用Hochest染料分选侧群细胞富集肺癌细胞系内的肺癌干细胞。然而,这些方法都不能提供直接证据以评估肺癌干细胞在肺癌化疗后复发中的作用。本研究的主要内容希望通过化疗药物筛选协同悬浮培养法富集耐药肺癌干细胞,为研究肺癌干细胞在肺癌复发中的作用提供体外模型。肺癌是世界范围内影响人类健康的恶性肿瘤。虽然肺癌早期诊断和综合治疗的策略已经使肺癌患者的生存期有所延长,但复发仍然是实现肺癌治愈的主要障碍。研究发现,30%-75%的肺癌患者手术切除及放化疗后将复发。越来越多的证据表明,肿瘤干细胞耐药性和高致瘤性可能是化疗后肿瘤复发的主要原因。肿瘤干细胞具有很强的自我更新及增殖潜力。有研究报道,仅仅10个肿瘤干细胞就能形成小鼠皮下移植瘤。显然,一些调节干细胞自我更新和增殖的信号通路在肿瘤干细胞内存在异常。在造血系统以及在其他正常组织中,成体干细胞进行不对称分裂,分裂过程中一个子细胞保持干细胞特性,同时其他短暂扩充细胞（Tansient amplifying cells, TACs）则进入分化过程,TACs分化中进行对称细胞分裂,产生具有相同“命运”的终末分化细胞。干细胞的自我更新过程是一个严格有序的步骤,但很可能在肿瘤及某些高增殖性疾病中被破坏。已经表明,乳腺肿瘤干细胞在分裂过程中不是通过不对称分裂,而是采用对称分裂的方式,加快了乳腺癌干细胞的自我更新和肿瘤发生的过程。决定肿瘤干细胞自我更新能力及其分裂方式的因素或者基因还不甚明确。有效的方式是采用突变或者基因沉默干扰基因的表达,来研究目的基因对肿瘤干细胞分裂模式的作用,并观察对肿瘤干细胞自我更新及致瘤能力的影响。研究发现,调控干细胞不对称分裂的某些基因是抑癌基因（tumor suppressing gene, TSG）。在肺癌中经常发生突变与沉默的抑制基因p53,有促进乳腺成体干细胞不对称分裂的作用,p53基因缺失能导致乳腺癌干细胞对称分裂。这显示了p53在决定肿瘤干细胞分裂模式及子代细胞命运的作用。p53基因是人类肿瘤中最频繁突变的抑癌基因,细胞中p53表达水平受到MDM2的调控,MDM2可通过结合并抑制p53转录和促进p53蛋白的降解而调节p53的含量。INK4a/ARF（Inhibitor of cyclin-Dependent Kinase 4a- Alternative Reading Frame）是一个调控细胞周期并抑制细胞分裂的抑癌基因。INK4a/ARF编码两个司职细胞周期调控的蛋白p14^ARF和p16INK4a。p14^ARF能结合Mdm2,抑制Mdm2和p53相互作用,活化p53蛋白。Bmi-1（B-cell specific moloney leukemia virusin sertion site 1）基因是多梳基因家族PcG（Polycomb group,PcG）中的重要成员之一,在调节干细胞自我更新、细胞增殖和衰老中发挥重要作用。Bmi-1可负性调控p14^ARF的表达,通过p14^ARF-Mdm2-p53通路,影响p53的表达。本研究采用顺铂体外化疗诱导结合无血清培养基悬浮培养的方法,从肺癌A549细胞中富集了一群自我分化能力强、高致瘤性的耐药肺癌干细胞,发现耐药肺癌干细胞中高表达Bmi-1,利用RNAi干扰沉默Bmi-1基因后,发现耐药肺癌干细胞的自我更新、增殖能力降低,与此同时耐药肺癌干细胞的分裂模式由对称分裂变为非对称分裂,抑制p53的表达能够恢复对称分裂。由此可见,Bmi-1通过p14ARF/MDM2/p53通路调控耐药肺癌干细胞的自我更新的分裂模式,以影响耐药肺癌干细胞在化疗打击后“干细胞池”扩增的过程。除此之外,我们还报道了一种利用自体瘤内成纤维细胞作为滋养层细胞培养人肺癌标本中CD133+/EpCAM+双阳性细胞的方法。发现利用自体瘤内成纤维细胞培养CD133+/EpCAM+双阳性细胞能使CD133+/EpCAM+双阳性细胞增殖较快、细胞球体积更大并且能保持更好的未分化状态。自体瘤内成纤维干细胞由于能提供体内相似细胞因子及微环境,因此能使肺癌干细胞在体外的培养下更能保持体内的状态。研究方法:1.自体瘤内成纤维细胞作为滋养层培养CD133+/EpCAM+双阳性细胞利用流式细胞仪分选3例肺癌手术标本中CD133+/EpCAM+双阳性细胞,使用差速贴壁法并从相同病人的手术切除瘤灶中分离出自体瘤内成纤维细胞。经过3d体外培养使CD133+/EpCAM+双阳性细胞形成较小的细胞球后,转移到自体瘤内成纤维细胞滋养层上培养。对CD133+/EpCAM+双阳性细胞在两种培养条件下的增殖速度、未分化状态、细胞多向分化及致瘤性等多方面进行比较。2.从肺癌A549细胞中分离对顺铂耐药肺癌干细胞并鉴定顺铂体外诱导A549肺癌细胞株3 d,一小部分耐药细胞存活。无血清培养用于选择性“饥饿”非干细胞耐药细胞,而干细胞则可在无血清培养基中球状生长。经过3代细胞球培养,收集第三代球细胞并对其干细胞特性进行了鉴定,包括干细胞标记、自我更新能力、多向分化和异种移植瘤的形成。3.Bmi-1基因在调控耐药肺癌干细胞自我更新、增殖的作用实时荧光定量PCR和免疫印迹检测肺癌干细胞中Bmi-1 mRNA和蛋白表达。设计针对Bmi-1的siRNA并利用慢病毒载体感染耐药肺癌干细胞,获得稳定的Bmi-1敲低细胞系定义为dsLCSCsBmi1-。为了研究Bmi-1对耐药肺癌干细胞自我更新和增殖的影响,分别采用WST-1增殖实验、细胞球形成实验和异种移植瘤形成实验观察各组差异,并用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期。4.耐药肺癌干细胞和dsLCSCsBmi1-分裂模式差异利用PKH 26染色和Numb蛋白的定位来观察肺癌干细胞和dsLCSCsBmi1-的分裂模式。干细胞标记CD133的免疫荧光染色可以证实PKH 26染色和Numb定位的结果。并利用p53特异性抑制剂,抑制p53表达初步探讨Bmi-1下游分子p53在决定肺癌干细胞分裂模式中的作用。研究结果:1.从肺癌标本中分离出的CD133+/ EpCAM+双阳性细胞,在自体瘤内成纤维细胞滋养层上生长状态良好,细胞倍增时间约为41h-47 h。同时,这些细胞持续表达干细胞标记CD133并保持未分化状态。免疫缺陷小鼠异体移植瘤形成和HE染色证明在滋养层上生长的CD133+/ EpCAM+双阳性细胞能保持其致瘤性和多向分化性。证明自体瘤内成纤维细胞滋养层培养法与传统的无血清培养基比较,能较好的保持干细胞的增殖活力与未分化状态。2.顺铂体外诱导A549细胞得到的顺铂耐药细胞,定义为DSCs,通过无血清悬浮传代培养,富集到一群能成球生长的耐药A549细胞,定义为dsLCSCs。通过表面标志物CD133、ABCG2检测、干细胞功能检测等途径鉴定这群细胞具有自我更新、多向分化和诱导异体移植瘤能力。流式检测发现约0.5?1.3%的A549细胞为CD133阳性细胞,DSCs中²0%为CD133阳性,相比之下> 85%的dsLCSCs为CD133阳性。ABCG2的免疫荧光染色显示,在相同的荧光强度背景下dsLCSCs荧光强度相较于DSCs和A549细胞中较强。自我更新实验中,仅有1.63%的A549细胞能形成细胞球,有23.81%的DSCs和85.34%的dsLCSCs能形成细胞球。当dsLCSCs被血清诱导分化后出现CK8和CK18标志物表达,证明了dsLCSCs的多向分化潜能。最重要的是,本实验还发现dsLCSCs比DSC和A549致瘤性更强。3.dsLCSCs细胞中Bmi-1基因的mRNA和蛋白水平都高表达。利用RNAi沉默Bmi-1表达,发现dsLCSCs细胞增殖、自我更新、体外致瘤能力都降低。4.Bmi-1能促进dsLCSCs细胞的对称分裂,沉默Bmi-1诱导dsLCSCs细胞进行非对称分裂。同时还证实了dsLCSCs中存在Bmi-1/p14ARF/MDM2/p53调控轴,发现通过p53抑制剂PFTα抑制p53表达,能重建dsLCSCsBmi1-细胞的对称分裂模式。结论:肿瘤干细胞可能是肿瘤复发的根源。为了研究肿瘤干细胞与化疗后肿瘤复发的关系,我们建立体外模型来观察耐药肺癌干细胞增殖及自我更新的特点。并探讨Bmi-1基因在调控耐药肺癌干细胞自我更新和分裂中的作用。结果证明通过顺铂诱导和无血清培养基悬浮培养相结合,能够选择性地富集耐药肺癌干细胞。Bmi-1基因在dsLCSCs中高表达,能促进dsLCSCs自我更新和增殖,而这种作用主要是通过促进dsLCSCs对称分裂扩大“干细胞池”的结果。同时本实验还证实了dsLCSCs中存在Bmi-1/p14ARF/MDM2/p53调控轴,初步证明了Bmi-1可能是通过p53影响dsLCSCs细胞分裂方式。