目的:随着人口老龄化、饮食结构以及生活方式的改变,糖尿病发病率逐年升高,预计到2030年全球糖尿病患者将增加至3.66亿。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常见、最严重的慢性微血管并发症之一,随着糖尿病发病率的升高,糖尿病肾病患者也越来越多,目前已成为我国导致终末期肾功能衰竭的主要原因之一,给家庭和社会带来了沉重的经济负担和精神压力,严重影响着人们健康。进一步揭示糖尿病肾病的发生、发展机制,探索防止或延缓病变进展的有效措施是国内外肾脏病学界热切关注的重要课题。糖尿病肾病的病因复杂,涉及多种机制,包括糖代谢紊乱、血流动力学改变、氧化应激与炎症损伤、细胞因子和遗传背景等。糖尿病肾病的主要临床表现为蛋白尿和进行性肾功能减退;其肾脏病理表现主要为肾小球系膜基质积聚、基底膜(GBM)增厚引起结节状或弥漫性肾小球硬化以及肾小管-间质纤维化。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分,足细胞损伤是蛋白尿的病理基础,是糖尿病肾病发生、发展过程中的重要环节,但迄今其发生机制尚未明确。自噬是溶酶体介导的细胞内蛋白和细胞器等物质的降解过程,是存在于真核生物细胞中的一种高度保守的保护性机制,对稳定细胞内环境、维持细胞的存活具有重要意义。目前研究发现,足细胞具有高水平的基础自噬活性,在高糖环境中,细胞信号通路发生改变,使细胞自噬功能受损,不能对各种应激产生保护性反应,且加重细胞器功能的紊乱和结构破坏,最终导致疾病的发生。足细胞自噬参与糖尿病肾病发生的机制研究已成为该领域的热点课题。此外,长期微炎症状态是糖尿病肾病发生发展的关键因素,不同途径激活的炎症机制参与了糖尿病肾病的病理生理。Toll样受体(TLRs)可在足细胞中表达,通过调控下游核因子κB(NF-κB)等信号分子的表达,激活炎症反应。已知TLRs信号通路的两条途径的关键因子分别为:髓样分化因子介导的88(My D88)接头蛋白,Toll样受体(TIR)适配器诱导干扰素β结构域的(TRIF)衔接蛋白。目前关于TLRs/NF-κB信号通路在糖尿病肾病发病机制中已有基础研究,但具体涉及到两个关键因子在糖尿病肾病中的具体表现少有描述。金雀异黄素(GEN)是从大豆中提纯的大豆异黄酮的主要组分。目前的基础研究表明,GEN能缓解糖尿病小鼠肾脏氧化应激、炎症和纤维化程度,发挥肾脏保护作用,但其作用机制并不明确。本研究我们应用生理浓度的GEN对高糖环境下小鼠足细胞自噬的影响作用进行了观察,同时也分析了GEN对TLRs/NF-κB信号传导通路和其中的相关炎症因子的干预机制,旨在探讨GEN在糖尿病肾病发生发展中的干预作用,为临床治疗提供实验性理论研究。方法：1 GEN对高糖环境下足细胞自噬的影响条件性永生化小鼠足细胞在33℃,γ-IFN存在的条件下培养传代后,于37℃,无γ-IFN的条件下培养10-14天,使细胞分化成熟。免疫荧光化学检测synaptopodin观察足细胞成熟情况。未分化成熟的足细胞不表达synaptopodin,合格的细胞被用于实验。①首先探究高糖环境足细胞自噬的最佳时间。不同时间点应用高糖培养成熟小鼠足细胞0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h,应用western blot检测微管相关蛋白3(microtubule Associated Protein Light Chain 3,LC3Ⅱ)确定高糖环境足细胞自噬的最佳时间。②在GEN(20μM)和时间(6h)条件下,分别设置正常糖组(5.5 m M,Normal glucose,NG)、甘露醇对照组(5.5 m M glucose+24.5 m M mannitol,MC)、高糖组(30 m M,High glucose,HG)、高糖+GEN组(30 m M HG+0.05%DMSO+20μM genistein,G)、高糖+自噬抑制剂(氯喹)组(30m M HG+1μM chloroquine,CQ)和高糖+氯喹+GEN组(30 m M HG+1μM CQ+0.05%DMSO+20μM GEN,CG),应用电镜观察自噬小体。③设置对照如上,应用免疫荧光化学,直观分析LC3和磷酸化雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,p-m TOR)的表达。④应用western blot检测LC3Ⅱ、p-m TOR的蛋白表达,应用western blot和real-time PCR方法检测nephrin的蛋白和基因水平,评估GEN对高糖环境足细胞自噬的影响。2 GEN对高糖环境下足细胞TLRs/NF-κB通路的干预作用①首先探究高糖环境足细胞NF-κB p65表达的最佳时间。不同时间点应用高糖培养成熟小鼠足细胞0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h,应用western blot检测NF-κB p65确定高糖环境足细胞NF-κB p65表达的最佳时间。②在GEN(20μM)和时间(48h)条件下,分别设置正常糖组(5.5 m M,Normal glucose,NG)、甘露醇对照组(5.5 m M glucose+24.5m M mannitol,MC)、高糖组(30 m M,High glucose,HG)和高糖+GEN组(30 m M HG+0.05%DMSO+20μM GEN,G),应用免疫荧光化学,直观分析核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB p65)的表达。③设置组如上,应用western blot,检测My D88、TRIF和NF-κB p65的蛋白表达,应用ELISA检测单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-l)。④应用western blot和real-time PCR方法检测nephrin的蛋白和基因水平,评估GEN对高糖环境足细胞内TLRs/NF-κB通路中的关键因子的干预作用,以及对足细胞的影响。3 GEN对高糖环境下My D88/TRIF基因敲减足细胞自噬的影响①优化转染条件,找出化学合成的si RNA沉默My D88/TRIF基因表达的最佳剂量。②将分化成熟的小鼠足细胞分为高糖组(HG)、高糖+对照si RNA组(HG+con.si RNA,HC)、高糖+My D88-si RNA组(HG+My D88-si RNA,M)、高糖+My D88-si RNA+GEN组(HG+My D88-si RNA+0.05%DMSO+20μM GEN,MG)组、高糖+TRIF-si RNA组(HG+TRIF-si RNA,T)、高糖+TRIF-si RNA+GEN组(HG+TRIF-si RNA+0.05%DMSO+20μM GEN,TG)、高糖+My D88-si RNA+TRIF-si RNA组(HG+My D88-si RNA+TRIF-si RNA,MT)和高糖+My D88-si RNA+TRIF-si RNA+GEN组(HG+My D88-si RNA+TRIF-si RNA+0.05%DMSO+20μM GEN,MTG)。经培养6h,应用免疫荧光化学,直观分析LC3和p-m TOR表达。③设置对照如上,应用western blot检测LC3Ⅱ和p-m TOR的蛋白表达,应用western blot和real-time PCR方法检测nephrin的蛋白和基因水平,评估基因敲减My D88/TRIF后GEN对高糖环境足细胞自噬的影响。4 GEN对高糖环境下My D88/TRIF基因敲减足细胞TLRs/NF-κB通路的干预作用将分化成熟的小鼠足细胞分为高糖组(HG)、高糖+对照si RNA组(HG+con.si RNA,HC)、高糖+My D88-si RNA组(HG+My D88-si RNA,M)、高糖+My D88-si RNA+GEN组(HG+My D88-si RNA+0.05%DMSO+20μM GEN,MG)组、高糖+TRIF-si RNA组(HG+TRIF-si RNA,T)、高糖+TRIF-si RNA+GEN组(HG+TRIF-si RNA+0.05%DMSO+20μM GEN,TG)、高糖+My D88-si RNA+TRIF-si RNA组(HG+My D88-si RNA+TRIF-si RNA,MT)和高糖+My D88-si RNA+TRIF-si RNA组+GEN组(HG+My D88-si RNA+TRIF-si RNA+0.05%DMSO+20μM GEN,MTG)。①经培养48h,应用免疫荧光化学,直观分析NF-κB p65的表达。②应用western blot,检测My D88、TRIF的蛋白表达,应用ELISA检测MCP-1。③应用western blot和real-time PCR方法检测nephrin的蛋白和基因水平,评估GEN对高糖环境足细胞内TLRs/NF-κB通路中的关键因子的干预作用,以及对足细胞的影响。结果：1 GEN对高糖环境下足细胞自噬的影响①33℃时的条件永生化小鼠足细胞,F-actin免疫荧光化学结果显示,细胞形状呈梭形或三角形,突起较少。Synaptopodin免疫荧光化学结果显示,细胞胞浆中几乎不表达。37℃经培养10-14天后的足细胞,F-actin免疫荧光化学结果显示,细胞胞浆向四周展开,突起增多。Synaptopodin免疫荧光化学结果显示,细胞胞浆中表达明显增强。②高糖环境足细胞自噬的时效关系实验结果显示:在高糖培养足细胞6h,LC3Ⅱ表达显著(P<0.01)。③电镜观察结果:在NG组和HG组均存在自噬小体,HG组中自噬小体较NG组偏多。④免疫荧光化学结果显示:LC3在HG组、G组、CQ组和CG组表达均比较明显。p-m TOR在HG组、G组表达偏弱,CQ组表达上调。⑤western blot结果显示:LC3Ⅱ在各组均有表达,LC3Ⅱ在HG组、G组、CQ组和CG组表达更为明显(P<0.01)。p-m TOR在HG组、G组表达下调(P<0.05),在CQ组表达水平偏高(P<0.01)。⑥nephrin的western blot和Real-time PCR检测结果显示:nephrin在HG组表达下降(P<0.01),CQ组较CG组表达下调(P<0.01)。2 GEN对高糖环境下足细胞TLRs/NF-κB通路的干预作用①高糖环境足细胞NF-κB p65表达的时效关系实验结果显示:在高糖培养足细胞48h,NF-κB p65的核转移表达显著(P<0.05)。②免疫荧光化学结果显示:NG和G组NF-κB p65主要在细胞胞浆中表达,HG组NF-κB p65主要在细胞胞核中表达。③western blot结果显示:My D88、TRIF在HG组较NG组表达上调(P<0.01),NF-κB p65的核蛋白表达在HG组较NG组显著(P<0.01)。④Nephrin的western blot和real-time PCR结果显示:NG组和G组中表达显著高于HG组。⑤ELISA检测结果显示:MCP-1在HG组较NG组和G组表达上调(P<0.01)。3 GEN对高糖环境下My D88/TRIF基因敲减足细胞自噬的影响①My D88-si RNA和TRIF-si RNA验证实验结果:My D88-si RNA和TRIF-si RNA能够显著敲减高糖环境足细胞My D88/TRIF蛋白和m RNA的表达。证实在6孔板中以70 pmol/孔转染足细胞敲减效果最好。②免疫荧光化学结果显示,LC3在MT组较其他组在胞浆表达较弱,MTG组较MT组表达上调。p-m TOR结果与其相反。③应用western blot检测LC3Ⅱ、p-m TOR和nephrin的蛋白表达结果:与HG组相比,LC3II在T组无明显变化(P>0.05),在M组、MT组表达下降(P<0.05);p-m TOR在M组、T组和MT组表达明显升高(P<0.01)。与M组相比,LC3II和nephrin在MG组表达明显上调(P<0.01);p-m TOR在MG组表达明显下降(P<0.01)。与T组相比,LC3II和nephrin在TG组表达明显上调;p-m TOR在TG组表达下降(P<0.05)。与MT组相比,LC3II和nephrin在MG组表达明显上调(P<0.01);p-m TOR在MG组表达明显下降(P<0.01)。④应用real-time PCR方法检测nephrin的基因水平,与HG组相比,nephrin在M组和T组无明显差异(P>0.05),M组水平偏高(P<0.05),MG组、TG组和MTG组表达明显偏高(P<0.01)。4 GEN对高糖环境下My D88/TRIF基因敲减足细胞TLRs/NF-κB通路的干预作用①免疫荧光化学结果:与HG和HC组相比,M组、T组和MT组中NF-κB p65在细胞核内表达明显减弱,以MT组表达最弱。加用GEN组中NF-κB p65在细胞浆表达相对明显。②ELISA检测MCP-1结果:与HG和HC组相比,M组、T组和MT组表达下调,GEN治疗组下调更为明显(P<0.01)。③应用western blot检测NF-κB p65和nephrin结果示:与HG组相比,nucleus NF-κB p65在M组、T组和MT组表达下降(P<0.01);nephrin在在M组、T组和MT组表达升高。与M组相比,nucleus NF-κB p65在MG组表达明显下降(P<0.01);nephrin在MG组表达明显升高(P<0.01)。与T组相比,nucleus NF-κB p65在TG组表达明显下降(P<0.01);nephrin在MG组表达明显升高(P<0.01)。与MT组相比,nucleus NF-κB p65在MTG组中无明显变化(P>0.05);nephrin在MTG组表达明显升高(P<0.01)。④应用real-time PCR方法检测nephrin结果:与HG组和HC组相比,敲减基因My D88/TRIF和应用GEN都可使nephrin表达上调(P<0.01)。⑤ELISA检测结果显示:与HG组相比,MCP-1在其他组均明显下调。(P<0.01)。结果：1在高糖刺激早期,GEN可通过促进细胞自噬发挥对足细胞的保护作用。2在高糖刺激晚期,GEN具有足细胞抗炎保护作用,其作用机制可能是通过抑制TLRs/NF-κB信号通路减轻足细胞炎症损伤所致。3在高糖刺激早期,GEN可减轻TLRs/NF-κB信号通路阻断后自噬的下降程度。4 GEN干预TLRs/NF-κB信号通路从早期抑制My D88开始,后期也对TRIF有抑制作用。而且在高糖刺激晚期,除了干预TLRs/NF-κB信号通路,GEN对足细胞的保护作用,还应包括其他机制。综上,本研究提示GEN在糖尿病足细胞的自噬和炎症损伤中发挥了作用,可促进足细胞自噬,抑制TLRs/NF-κB通路活化,对高糖培养小鼠足细胞有保护作用。