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目的:近年来由于高脂高热量饮食习惯的普及,使得非酒精性脂肪性肝(non-alcoholic fatty liver,NAFLD)的患病率在世界范围不断攀升,严重威胁人类健康。高脂饮食诱导NAFLD损伤在不同程度上引发糖脂代谢异常、氧化应激、炎症等反应。因此探明NAFLD病理进程的发病机制,对于制定有效的治疗策略尤为重要。大黄素(EMO)是中药大黄的主要生物活性成分,具有降脂、抗炎、抗氧化、保肝利胆的药理作用。本课题在研究大黄素药理学中发现,大黄素能够激活法尼酯X受体(Farnesoid X receptor,FXR)及其靶基因,而FXR作为肝病热点研究基因在大黄素发挥药效中的机制尚不清楚。因此,本实验目的是研究大黄素对高脂饮食诱导的NAFLD损伤的保护作用并阐述相关分子机制,为大黄素临床治疗NAFLD提供药理学依据。方法:1.EMO改善OAPA诱导的肝细胞脂肪堆积药效及其分子机制研究提取分离培养小鼠原代肝细胞,油酸给药建立细胞脂质堆积模型,EMO给药干预,检测细胞内TG、TC含量,并运用油红和苏木素双染色评估脂质清除情况,运用q RT-PCR检测FXR相关通路中m RNA表达情况。2.EMO对高脂饮食诱导NAFLD损伤的保护作用及分子机制研究选取60只SPF级雄性C57BL/6小鼠。首先,随机将小鼠分成2组,按对照组(标准饲料)(n=10)和HFD对照组(n=50)饲喂12周。第二步,将HFD对照组分为5组(n=10),分别按照HFD、HFD+OCA(OCA,40 mg/kg)、HFD+EMO-H(80 mg/kg)、HFD+EMO-M(40 mg/kg)、HFD+EMO-L(20 mg/kg)处理。对照组和HFD组小鼠灌胃生理盐水每天一次,其余各组灌胃给药每天一次,连续给药8周。于第8周末禁食12h后,取样。对小鼠体重、肝重、葡萄糖耐量、胰岛素耐量、空腹血糖等进行观察;血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量进行检测;H&E病理组织染色和油红染色进行肝组织病理分析;运用q RT-PCR对相关通路基因m RNA进行检测。3.证明FXR在EMO缓解高脂饮食诱导的NAFLD损伤作用中重要作用挑选SPF级雄性Nr1h4 knockout小鼠(FXR-/-mice)小鼠40只(20-22g),第一步,将小鼠随机分成2组,按对照组(标准饲料)(n=10)和HFD对照组(n=30)饲喂12周。第二步,将HFD对照组分为3组(n=10),分别按照HFD、HFD+OCA(OCA,40 mg/kg)、HFD+EMO(80 mg/kg)处理。对照组和HFD组小鼠每天灌胃生理盐水一次,其余各组每天灌胃给药一次,连续给药8周。于第8周末禁食12h后,取样。对小鼠体重、肝重、葡萄糖耐量、胰岛素耐量等进行观察;血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、白介素(IL-6、IL-1β)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量进行检测;H&E病理组织染色和油红染色进行肝组织病理分析;运用q RT-PCR对相关通路基因m RNA进行检测。结果:1.在肝原代细胞实验中,EMO降低OAPA诱导的MPHs细胞内TG水平(P<0.01或P<0.05),油红染色显示减少了肝原代细胞内脂滴数量,并通过上调FXR、SHP表达量(P<0.01或P<0.05),降低细胞内脂质堆积。在FXR基因缺失后,EMO未能上调FXR、SHP及BSEP的m RNA表达量。2.在HFD诱导的NAFLD损伤模型中,EMO降低了NAFLD小鼠的体重、肝重(P<0.01或P<0.05);降低小鼠GTT、ITT以及空腹血糖(P<0.01或P<0.05),提高IRS-1、PI3K等m RNA表达量(P<0.01或P<0.05),改善了胰岛素敏感性;降低血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)(P<0.01或P<0.05),降低SREPB1c、Fas等m RNA表达量(P<0.01或P<0.05),改善了脂质堆积。降低血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)水平、白介素(IL-6、IL-1β)水平(P<0.01或P<0.05),降低TNFα、IL-1β和IL-6等m RNA表达量(P<0.01),缓解炎症浸润;降低血清丙二醛(MDA)水平(P<0.01);提升超氧化物歧化酶(SOD)水平(P<0.01),增加Nrf2、AMPK等m RNA表达量,改善了抗氧化能力。3.在FXR-/-小鼠中建立HFD诱导的NAFLD损伤模型,EMO未能有效降低NAFLD小鼠的体重、肝重;对于小鼠GTT、ITT以及空腹血糖水平降低无统计学意义;血清生化指标中,对于总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG),天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、白介素(IL-6、IL-1β)、丙二醛(MDA)水平无明显降低,提升超氧化物歧化酶(SOD)水平无明显提升;4.FXR-/-小鼠与WT小鼠进行组间对照,在脂质通路方面,EMO对于FXR的调控明显低于WT小鼠(P<0.01),对于SREPB1c、Fas调控明显高于WT小鼠(P<0.01或P<0.05);在糖代谢通路方面,对于IRS-1、PI3K、PEPCK及G6Pase的调控明显高于WT小鼠(P<0.01);在炎症通路方面,对于TNFα、IL-1β和IL-6的调控明显高于WT小鼠(P<0.01);在氧化应激通路方面,对于Nrf2、AMPK的调控明显低于WT小鼠(P<0.01或P<0.05);表明敲除FXR后,EMO失去保护HFD诱导NAFLD损伤的能力。结论:EMO可以通过激活FXR通路调控下游靶基因,抑制SREPB1c、IRS-1、TNFα等的表达,增加了Nrf2、AMPK的表达,减轻代谢应激,降低肝脏损伤,从而降低HFD诱导小鼠的体重,降低血糖血脂,改善炎症、氧化应激水平,达到改善NAFLD小鼠的糖脂代谢异常的作用。