本文选择严重危害养猪业、并具有重要公共卫生学意义的猪蛔虫作为研究对象，应用抑制消减杂交技术，构建感染期幼虫差异表达的cDNA文库，从而获得大量的感染期幼虫相关基因；再应用cDNA微阵列表达谱芯片技术进一步筛选感染期幼虫差异表达基因，通过EST测序及序列比对分析，获得每个EST代表的相关生物学信息；并应用半定量RT-PCR方法分析感染期幼虫部分差异基因在猪蛔虫各期幼虫、虫卵和成虫的表达情况；选择与幼虫发育相关的两个ESTs，应用RNA干扰技术，初步探讨其基因序列的功能。 采用低浓度(0.4％)琼脂凝胶结合贝尔曼氏法分离幼虫的方法，获得了大量高纯度的幼虫，从而保证了总RNA的质量。在此基础上，应用抑制消减杂交(SSH)技术，构建了猪蛔虫感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库，并采用斑点杂交技术检测了该文库的特异性。小量的测序及序列分析进一步验证了所获得的消减cDNA文库具有良好特异性。 从所构建的消减cDNA文库中挑选阳性克隆2671个，PCR扩增其插入片断，经纯化后点样于预先处理好的基片上，制备成cDNA微阵列芯片。用二种不同的荧光染料通过逆转录反应将各发育期虫体的mRNA分别标记成二种荧光的探针，共5组探针，即感染期幼虫与雌虫、感染期幼虫与雄虫、感染期幼虫与L4、感染期幼虫与肺中L3、感染期幼虫与虫卵，将探针混合后与基因芯片进行杂交、洗涤，用特有的二种荧光波长扫描芯片，得到点样克隆在不同样本中的表达谱，通过计算机软件处理分析，从而得出这些克隆在各发育期虫体差异表达的情况，并将这5组探针杂交分别获得的信息综合，筛选出感染期幼虫差异表达于其它发育期虫体的基因。 实验对同一克隆在同一基片不同位置进行双点杂交，以及反标杂交都保证了实验数据的有效性和准确性。每组探针在正反标中同时都存在表达差异的基因克隆，即一个克隆，在两张芯片上共有4个信号值同时存在差异性的分别有1684，2117，1828，2233，2504 个，这些数据所代表的基因在与两种探针杂交时表现出较大的差异，且上下调趋势一致，程度相似。同一个克隆在10张芯片上同时存在差异的有1526个，即感染期幼虫基因相对于其它各期虫体(雌虫、雄虫、L4、L3和虫卵)都存在差异的克隆数有1526个。 根据芯片杂交结果，筛选出表达差异最明显的前515个克隆进行测序，获得有效序列498个，这些序列去除载体和接头后，采用100bp，90％的原则对这些有效序列进行基因归并，获得单个ESTs 91个。序列相似性搜索结果表明，64个ESTs与已知的 ESTs 有74％～100％的相似性，27个无相似性。对非冗余性数据库进行Blastn和Blastx分析表明，43个ESTs与GenBank中的非冗余性数据库的基因序列具有明显相似性，48个ESTs没有明显相似性，可认为是新的ESTs。在这43个具有相似性的ESTs中，23个ESTs与23个新杆属线虫的基因序列具有相似性，13个ESTs与9个猪蛔虫和其它寄生线虫的基因序列具有相似性，7个ESTs与其它物种的基因序列具有相似性。这些相似性基因序列编码的蛋白主要包括一些蛋白激酶或磷酸酶、烯醇酶、神经肽样多肽及其前体、小热休克蛋白、Poly A结合蛋白、核糖体蛋白大亚基家族成员及PDZ结构域包含蛋白等。采用RT-PCR对16个差异基因在不同发育期虫体的mRNA丰度进行半定量分析。本研究结果表明，目的基因在猪蛔虫感染期幼虫中呈高丰度表达，与表达谱cDNA芯片的结果一致，进一步验证了消减文库的差异性。 首次以体外脱鞘的感染期幼虫为对象，采用RNAi技术，初步探讨了猪蛔虫感染期幼虫的两个相关基因的功能。选择编码猪蛔虫感染期幼虫磷酸烯醇丙酮酸羧激酶EST序列18E12和新的EST 07E12，采用浸泡的方法，将其dsRNA直接导入体外脱鞘的感染期幼虫中，通过RT-PCR检测了所选目的基因产生的干扰效果。 针对目的序列设计特异引物及连接T7启动子的引物，扩增获得的DNA5’端连有T7启动子，在RNA聚合酶的作用下，转录合成dsRNA，通过浸泡的方式将dsRNA导入感染期幼虫中，在浸泡后的4个不同的时间点提取实验组和对照组虫体的总RNA，通过RT-PCR检测浸泡入虫体的dsRNA发生干扰的效应。实验结果表明，对18E12，在浸泡后24h、48h检测到了相对应的基因表达的存在，因此，可以认为，浸泡的dsRNA没有进入虫体，或浸泡的dsRNA已经进入虫体，但是还没有发生互补链的降级或只发生了少量互补链的降解。往后的时间，即浸泡后的72h和96h，只在对照组检测到了对应的RNA。这初步表明，导入虫体内的dsRNA发挥了干扰效应，将其互补的链降解。07E12的浸泡试验中，在浸泡后24h、48h、72h都检测到了相对应的基因表达的存在，但表达量随时间依次减少，在96h之后在实验组没有检测到07E12的相应RNA的表达，说明dsRNA进入虫体并逐渐发挥了干扰作用。 本研究应用抑制消减杂交技术，结合cDNA微阵列表达谱分析，筛选出猪蛔虫感染期幼虫的差异表达基因，并应用RNAi技术初步研探讨了两个差异表达基因的功能，这些研究结果为发现新的药物靶标及新的疫苗候选分子奠定了基础，并对最终阐明寄生线虫发育的分子机制、有效防治寄生线虫病具有重要意义。