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骨质疏松是以骨密度减小、骨量减少、骨脆性增加和易发骨折为表现的复杂多基因疾病。骨质疏松症由骨密度定义,骨密度的遗传力约50-80%。全基因组关联研究(Genome-wide association studies,GWAS)是揭示复杂疾病易感基因和影响复杂性状基因变异的有效方法,过去十年GWAS发现了大量与骨质疏松症/骨密度相关联的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP),对这些SNP功能和作用机制的探索是后GWAS时代面临的主要挑战。miRNA是真核生物中一类内源性非编码的单链小分子RNA,长约20-25 nts,可通过碱基互补配对原则识别靶基因3’ UTR上的结合位点,调节基因转录后水平的表达,进而参与疾病发生等多种生理过程。本研究的目的:(1)探索GWAS SNP rs1026364(C/A)是否影响m iR-345-5p的结合及对Usf3表达的调控;(2)在成骨系统中研究miR-345-5p的功能;(3)鉴定miR-345可能的靶基因。(4)探索转录因子Usf3在骨生物学的功能。用miRSNP,MirSNP,mrSNP,SNPinfo和mirsnp等软件分析骨质疏松/骨密度GWAS 关联 SNP 对 miRNA-mRNA 互作的影响,发现 GWAS SNP rs1026364(P=4.10E-10)(Reference Allele C→ Alternative Allele A)产生了 一个miR-345-5p 的结合位点,即miR-345-5p特异性结合Usf3基因的A等位基因。而SNP rs884205等位基因为A→C时,Rank的3’UTR区产生一个miR-3658-5p的结合位点。双荧光素酶报告基因检测显示,外源共转染A Allele + miR-345组Usf3的转录活性下调到76%,而C等位基因时无影响。三种细胞系293T、U-20S和Saos-2中rs1026364 C/A等位基因转录活性都存在显著差异,A等位基因始终低于C等位基因。抑制骨肉瘤细胞Saos-2的内源miR-345,则A等位基因的转录活性上调至C等位基因相当水平。U937细胞rs1026364基因型为A/C杂合子。在U937细胞中过表达mi R-345,内源Usf3显著下调28%。GWAS SNP rs884205的验证结果显示,C等位基因时,miR-3658并未下调Rank的转录活性。因此,我们的实验结果表明GWAS SNP rs1026364(C/A)影响 miR-345-5p 与 usf3的结合,而 rs884205 不影响 miR-3658与Rank的结合。在骨肉瘤细胞U-20S中转染miR-345-5p模拟物(agomir),细胞的矿化结节量和ALP活性显著下降,且成骨分化早期标志基因Runx2、Osterix和中期标志基因碱性磷酸酶(Alp)、Ⅰ型胶原蛋白al链(Collal)、骨桥蛋白(Osteopontin)均显著下调。与之相反,转染miR-345-5p抑制剂(antagomir),U-20S细胞的矿化结节量增加至1.4倍,同时ALP活性亦显著上调1.6倍,各成骨分化标志基因也显著增加,但晚期标志基因Osteocalcin上调不明显。这些结果表明miR-345具有抑制成骨分化的功能。利用TargetScan6.2/7.0 预测Runx3、Smad1、Klf10 和 Mapk1是 miR-345-5p 的靶基因,双荧光素酶报告基因检测发现,miR-345下调野生型Runx3和Smad1的转录活性,但对野生型Klf10和Mapk1的下调不明显。U-20S细胞中过表达miR-345-5p,qPCR结果显示Runx3和Smad1内源表达分别显著下调至19.8%和32.7%;抑制miR-345-5p,Runx和和Smad1表达量分别增加到2.6倍和5.3倍,说明Runx3和Smad1 是 miR-345-5p 的靶基因。BLASTP分析发现Usf3为脊椎动物所特有。在U-20S中,当Usf3被shRNA敲降至40%时,Runx2、Osterix和Alp的内源表达分别下降至39%、61%和35%。双荧光素酶报告基因检测数据显示Usf3正调控Runx2的启动子活性,促进成骨分化。本研究首次揭示GWAS SNP rs1026364(C/A)通过影响miR-345-5p与Usf3的结合与骨质疏松症相关联的分子病理学新机制;证明miR-345具有抑制成骨分化的功能,Usf3、Runx3和Smad1均为miR-345的靶基因;初步鉴定Usf3可促进成骨分化。