能与植物原生质膜上高度特异的蛋白受体结合从而诱导植物产生防卫反应的分子统称激发子,其中从一些真菌菌丝细胞壁或培养滤液中提取的激发子尤其受关注。真菌激发子可被用于研究植物过敏反应的机理,其编码基因有可能被用于转基因操作从而获得具有抗病性能的植物材料。本论文以一分离自长春花叶片的疫霉为材料,开展了激发子的蛋白纯化,基因分离和原核表达等研究,主要研究结果如下: 1.从疫霉培养液中通过沸水浴、硫酸铵沉淀、非变性电泳、割胶电洗脱等纯化步骤,分离得到一种分子量约为31kD的耐高温的胞外分泌型蛋白。此蛋白在低浓度下能引起烟草叶片发生过敏反应;处理烟草悬浮细胞12hr后有44.6%的细胞死亡,24hr后有96.1%的细胞死亡,表明此蛋白具有激发子活性。此蛋白的N-端氨基酸序列与一些已报道的疫霉激发子高度同源,但其分子量与已报道的疫霉激发子有明显差异,有可能是一种新的疫霉激发子。 2.真菌核糖体RNA编码基因的ITS(internal transcribed spacer)序列在种内保守性强,但在种间变异丰富,被广泛用于亲缘关系较近的分类群的系统发育研究。本实验利用rDNA-ITS序列对所用疫霉进行分子鉴定,序列同源性比对结果显示其rDNA-ITS序列与烟草疫霉的同源性高达99%以上,据此推测所用疫霉可能属于烟草疫霉。 3.以已知的Phytophthora nicotiana激发素编码基因序列设计引物,以本文所用疫霉的RNA为模板,通过RT-PCR获得了激发素编码基因,同时获得了一个第63和223碱基发生了突变的序列,此突变体的第63碱基G突变为A,但编码的第21位氨基酸未变,仍是丝氨酸:然而第223碱基由A突变成G则导致第75位氨基酸由苏氨酸变成了丙氨酸。第75位氨基酸在激发素诱导烟草过敏反应中的作用还未见报道。将此激发素基因及其突变体分别转入pGEX-4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌,经IPTG诱导都能产生特异产物,表达产物的分子量均为36kD,恰好是激发素与GST分子量之和,表明两种表达产物是融合蛋白。这两种融合蛋白在低浓度下接种烟草叶片和处理烟草悬浮细胞,均能诱导烟草细胞死亡,处理悬浮细胞12hr后细胞死亡率均达到31%以上,处理24hr后死亡率均达到56%以上,远高于对照处理,且突变序列表达产物的作用略高于未突变序列表达产物的作用。