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海洋微生物用于抗病毒方面的研究不多,特别抗植物病毒的研究少见报道。本研究以烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)为靶标,利用福建省丰富的海洋资源,获得具有抗病毒活性的菌株,为微生物农药的研发提供理论和物质支持。 本研究筛选出对烟草花叶病毒(TMV)有抑制作用的6个细菌菌株。通过初筛重点研究了活性较强的菌株9a和10b:采用半叶法测定对烟草花叶病毒(TMV)的钝化作用,其抑制率分别达到95.26%、92.18%;采用圆片法测定对烟草花叶病毒体外抑制增殖作用,抑制率分别为36.1%、35.1%。通过喷施处理,两菌株培养液可以体内抑制TMV增值,抑制率分别是15.18%、39.76%,可以提高过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等防御酶的活性以及叶绿素含量的增加,诱导烟草对TMV的系统侵染产生抗性;两菌株培养液对侵染位点具有保护作用,抑制率为62.14%、62.36%。同时两菌株对苹果干腐病菌(Botryosphae riadothidea)、西瓜炭疽菌(Colletetrichum orbiculare)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.)等多种病原真菌具有拮抗作用,在普通光学显微镜观察下显示,两菌株可抑制菌丝生长,造成菌丝分支增多,顶端和中央膨大等畸变。 为了明确两株细菌的分类地位,本研究对两菌株进行了生物学和分子生物学鉴定。9a、10b菌株的形态特性和培养特征及生理生化的性质可以初步确定为芽孢杆菌,采用16S rDNA序列分析方法,通过克隆测序获得16SrDNA基因序列,序列已登录Genbank,登录号为DQ432009,DQ432010,利用CLUSTAL、MEGA、在线BLUST等生物信息学软件对序列进行分析,9a的序列与芽孢杆菌属中蜡样芽孢杆菌种(Bacillus cereus)的16SrDNA序列具有很高的同源性,达到99%;而10b的序列与水生芽孢杆菌(Bacillus aquimaris)的16SrDNA序列具有99%的同源性。因此,从分子角度进一步确定9a为海洋蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),10b为水生芽孢杆菌(Bacillus aquimaris)。 在发酵液活性初筛的基础上,选择菌株9a蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)作为进一步研究对象。结果表明,抗病毒活性部分不能通过有机溶剂萃取出来。通过硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析和Sephadex G—50凝胶过滤层析,纯化得到一个对TMV侵染具有抑制作用的蛋白,SDS—PAGE电泳显示其分子量约为26KDa,当浓度为50μg/mL时,该蛋白在心叶烟上对TMV侵染的抑制率达80.2%。