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目的:对注射用血塞通(冻干)(简称“血塞通”)引起的过敏样反应进行评价,明确其反应性质,筛查其诱发过敏样症状的主要成分,并探究血塞通及其致敏主要成分诱发过敏样反应的机制途径,为血塞通的临床安全性及再评价提供实验参考。方法:1.过敏反应检测:采用《中药、天然药物免疫毒性(过敏性、光变态反应)研究技术指导原则》推荐的豚鼠主动过敏试验方法以及课题组创建的基于血液生物标志物检测的小鼠-大鼠过敏试验方法对血塞通的过敏反应进行评价,以生理盐水为阴性对照,OVA为阳性对照,同时设置相应的佐剂组,经过3次致敏再激发后,对各组症状反应进行观察记录,按照相应的全身致敏性评价标准,对出现的症状进行评价。小鼠在此基础上采集血液样本检测血液生物标志物含量并制备抗血清进行大鼠异种PCA试验。利用该两种方法综合评价血塞通的过敏性。2.类过敏反应检测:选用体外细胞类过敏试验模型P815和RBL-2H3细胞,检测与血塞通共同孵育后释放至上清液中的脱颗粒介质水平,初步评价其类过敏反应。选用小鼠全身类过敏试验方法,观察静脉注射血塞通后小鼠出现的类过敏反应症状,检测血液生物标志物水平变化,结合整体试验和细胞试验对血塞通的类过敏性进行综合评价。3.类过敏成分筛查:选用体外P815、RBL-2H3细胞类过敏试验方法和小鼠全身类过敏试验方法对血塞通的主要成分人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的类过敏性进行综合评价,筛查血塞通中诱发类过敏反应的主要物质成分。4.类过敏反应机制途径研究:以血塞通及类过敏物质人参皂苷Rb1、Rg1为受试物,检测体外给药致RBL-2H3细胞脱颗粒后细胞上清液中活性介质的水平,考察静脉注射后小鼠血液中特征因子C3、C5a(补体总途径)、C1q(经典途径)、FD(旁路途径)的变化,分析血塞通及致敏成分的类过敏反应机制。结果:1.过敏反应试验:(1)豚鼠全身主动过敏试验:血塞通过敏反应症状呈阴性。(2)基于血液生物标志物检测的小鼠-大鼠全身过敏试验:血塞通静脉注射激发后,小鼠症状反应评定为过敏反应弱阳性,血液生物标志物除激发后b-氨基己糖苷酶水平有所升高外,组胺、类胰蛋白酶和Ig E均无明显变化。血塞通组抗体血清致敏大鼠皮肤,再静脉注射血塞通激发后未出现蓝斑。且小鼠抗体血清样品中Ig E未见明显升高。2.类过敏反应试验:(1)体外细胞试验:血塞通1-8 mg/m L浓度药液与细胞共育,P815细胞上清液中脱颗粒介质水平无显著变化;RBL-2H3细胞上清液中组胺、β-氨基己糖苷酶和类胰蛋白酶呈浓度依赖性升高,其中,4-8 mg/m L浓度下组胺、类胰蛋白酶,8mg/m L浓度下β-氨基己糖苷酶升高具有统计学意义。(2)小鼠全身类过敏试验:血塞通单次静脉注射,各剂量组均出现了不同程度的症状反应。60-120 mg/kg剂量时,症状反应强度为弱阳性/可疑;240-480 mg/kg时,症状反应强度为阳性和强阳性。血液生物标志物检测结果显示60-120 mg/kg剂量时,血液组胺、b-氨基己糖苷酶和类胰蛋白酶水平均无明显变化;240 mg/kg时组胺,480 mg/kg时组胺、b-氨基己糖苷酶、类胰蛋白酶升高具有统计学意义。3.类过敏成分筛查:(1)体外细胞试验(1)P815细胞:a.血塞通主要成分组合物1-8 mg/m L浓度与细胞共育,其上清液中组胺呈无规则的降低,类胰蛋白酶无明显变化,仅8mg/m L浓度时β-氨基己糖苷酶上升具有统计学意义;b.三七皂苷R1 0.15-1.2 mg/m L浓度与细胞共育,上清液中组胺、β-氨基己糖苷酶和类胰蛋白酶均无明显变化;c.人参皂苷Rb1 0.4-3.2mg/m L浓度与细胞共育,上清液中组胺未见明显升高,β-氨基己糖苷酶和类胰蛋白酶则呈浓度依赖性升高,其中,1.6、3.2 mg/m L浓度下β-氨基己糖苷酶、3.2mg/m L浓度下类胰蛋白酶升高具有统计学意义;d.人参皂苷Rg1 0.45-3.6 mg/m L浓度与细胞共育,其上清液中组胺呈下降趋势,类胰蛋白酶水平则呈浓度依赖性升高,3.6 mg/m L浓度下升高具有统计学意义。(2)RBL-2H3细胞试验:a.血塞通主要成分组合物在1-8 mg/m L浓度与细胞共育,2-8 mg/m L浓度下组胺、8 mg/m L浓度下类胰蛋白酶升高具有显著性;b.三七皂苷R1 0.15-1.2 mg/m L浓度与细胞共育,上清液中组胺有下降趋势,β-氨基己糖苷酶、类胰蛋白酶未见明显变化;c.人参皂苷Rb1 0.4-3.2 mg/m L浓度与细胞共育,0.4、1.6、3.2 mg/m L浓度下组胺,0.4、0.8、3.2 mg/m L浓度下β-氨基己糖苷酶,0.8、1.6 mg/m L浓度下类胰蛋白酶升高均具有统计学差异;d.人参皂苷Rg1 0.45-3.6 mg/m L浓度与细胞共育,上清液中组胺、β-氨基己糖苷酶、类胰蛋白酶均未见明显增加。(2)小鼠全身类过敏试验:(1)血塞通主要成分组合物:单次静脉注射,其在60、120 mg/kg剂量下症状评定为弱阳性/可疑,血液生物标志物水平无明显变化;在240、480 mg/kg剂量下症状强度评定为强阳性,血液组胺及β-氨基己糖苷酶亦呈显著升高,但类胰蛋白酶仅在480 mg/kg剂量下显著升高。(2)三七皂苷R1:单次静脉注射,小鼠仅在72 mg/kg剂量下类过敏症状表现为阳性,但血液生物标志物水平与对照组相比均无明显升高。(3)人参皂苷Rb1:单次静脉注射,在96 mg/kg和192 mg/kg剂量下类过敏症状强度评定为阳性,血液组胺及β-氨基己糖苷酶亦显著升高,类胰蛋白酶变化不显著。(4)人参皂苷Rg1:单次静脉注射,在54、108、216 mg/kg剂量下类过敏症状强度评定为阳性或强阳性,血液组胺亦升高显著,β-氨基己糖苷酶和类胰蛋白酶变化不显著。4.类过敏反应机制(1)直接刺激MC/BAS脱颗粒情况:血塞通1-8 mg/m L浓度下与RBL-2H3细胞共育,其上清液中脱颗粒成分增加,4-8 mg/m L浓度下的组胺、8 mg/m L浓度下的b-氨基己糖苷酶和类胰蛋白酶明显增加;人参皂苷Rb1在0.4-3.2 mg/m L浓度下与RBL-2H3细胞共育,其上清液中脱颗粒介质水平均呈明显升高,0.4、1.6、3.2 mg/m L浓度下的组胺、0.4、0.8、3.2 mg/m L浓度下的b-氨基己糖苷酶、0.8、1.6 mg/m L浓度下的类胰蛋白酶均显著增加;人参皂苷Rg1在0.45-3.6 mg/m L浓度下与RBL-2H3细胞共育,其上清液中脱颗粒成分未发生明显变化。(2)补体相关途径激活情况(1)血塞通以240 mg/kg剂量静脉注射,小鼠血液C3、C5a、C1q水平有一定的下降,其中C3和C1q水平下降显著,而FD水平无显著变化。(2)Rb1以192 mg/kg剂量静脉注射,小鼠血液C3、C5a、C1q水平均呈显著下降,而FD水平无显著变化。(3)Rg1以216 mg/kg剂量静脉注射,小鼠血液C3、C5a、C1q、FD水平均有一定的下降,但仅216 mg/kg剂量组血液C5a水平下降显著。结论:1.注射用血塞通(冻干)过敏反应为阴性,类过敏反应为阳性,其类过敏反应阳性起始剂量为240 mg/kg,相当于临床等效剂量的4倍。2.注射用血塞通(冻干)主要成分人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1类过敏反应为阳性,其阳性起始剂量分别为96 mg/kg和54 mg/kg,分别相当于临床等效剂量的4倍和2倍。三七皂苷R1类过敏反应为阴性。提示血塞通主要成分中人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1可能为诱发类过敏的主要物质成分。3.血塞通和人参皂苷Rb1诱导的类过敏反应主要是通过直接作用和经典途径。人参皂苷Rg1诱导的类过敏反应的机制尚待有作进一步研究。