目的
　　研究益肾化浊方对12月龄SAMP8小鼠海马神经元自噬过程中关键靶点表达的调控作用，探讨该方改善SAMP8小鼠学习记忆能力的作用机制，并初步阐释其组方内涵，进而为临床应用益肾化浊法治疗阿尔茨海默病提供部分实验证据。
　　方法
　　80只雄性12月龄SAMP8小鼠随机分为4组，模型（SAMP8）组、益肾化浊方（YSHZ）组、益肾（YS）组、化浊（HZ）组，每组20只。选用20只雄性12月龄SAMR1小鼠作为对照（SAMR1）组。各组小鼠采用灌胃干预，每天1次，持续4周。YSHZ、YS、HZ分别给予益肾化浊方、益肾方、化浊方，给药量参考《药理实验方法学》计算得到，分别为6.24g?kg-1?d-1、4.68g?kg-1?d-1、1.56g?kg-1?d-1；SAMP8和SAMR1组给予等量蒸馏水。（1）采用Morris水迷宫检测各组小鼠搜索模式、逃避潜伏时间、穿越平台次数、初始角、目标象限路程占比的变化，评估益肾化浊方对SAMP8小鼠学习和空间记忆能力的影响。（2）采用尼氏染色和透射电子显微镜，观察各组小鼠海马CA1区神经的排列状态数量及微观结构变化。（3）采用甘氨酸银浸染色、免疫组化和Westernblot检测，观察各组小鼠海马CA1区Aβ表达水平变化。（4）采用Westernblot检测，观察各组小鼠海马区自噬启动环节关键蛋白（mTOR、p-mTOR、PI3K3、Beclin1、p-Bcl2）相对表达量变化。（5）采用透射电子显微镜、Westernblot、RT-PCR和免疫荧光双染检测，观察各组小鼠海马CA1区神经元的自噬体、Aβ清除情况和自噬核心环节中各关键蛋白（Atg7、Atg12-Atg5复合体、LC3Ⅱ、VAMP8、p62）、基因（p62）相对表达量的变化。
　　结果
　　（1）Morris水迷宫结果
　　定向航行实验：①游泳速度：各组间小鼠游泳速度差异无统计学意义（P＞0.05），说明各组间小鼠体能无显著差异，避免速度对其他指标的影响。②搜索模式，经过5天训练学习，SAMR1组小鼠趋向式和直线式模式逐渐增多，SAMP8组小鼠边缘式模式变化不明显，YHSZ、YS、HZ组小鼠随机式和趋向式模式有所增多。③逃避潜伏时间，经过5天的学习：组内比较，SAMR1组逃避潜伏时间显著减少（P＜0.05）；SAMP8组避潜伏时间差异无统计学意义（P＞0.05）；YSHZ组逃避潜伏时间显著减少（P＜0.05）；YS、HZ逃避潜伏时间有下降趋势，差异无统计学意义（P＞0.05）。组间比较，第1天，与SAMR1组比较，SAMP8、YSHZ、YS、HZ组逃避潜伏时间显著增加（P＜0.05）；与HZ组比较，YSHZ组逃避潜伏时间显著减少（P＜0.05）。第2、3、4天，与SAMR1组比较，SAMP8、YSHZ、YS、HZ组逃避潜伏时间显著增加（P＜0.05）。第5天，与SAMR1组比较，SAMP8、YSHZ、YS、HZ组逃避潜伏时间显著增加（P＜0.05）；与SAMP8组比较，YSHZ组逃避潜伏时间显著减少（P＜0.05）；与HZ组比较，YSHZ组逃避潜伏时间显著减少（P＜0.05）。
　　空间探索实验：①探索模式：SAMR1组小鼠多围绕水池中心进行游泳搜寻，且对目标象限趋向性明显；SAMP8组小鼠多沿水池边缘搜寻，无明显特定象限的趋向性；YSHZ组小鼠多围绕水池中心进行游泳搜寻，对目标象限有一定的趋向性；YS组小鼠多围绕水池中心进行游泳搜寻，无明显特定象限的趋向性；HZ组小鼠多成随机方式游泳搜寻，无明显特定象限的趋向性。②初始角：与SAMR1组比较，SAMP8、YS组初始角度数显著增大（P＜0.05）；与SAMP8组比较，YSHZ组初始角度数显著减少（P＜0.05）；与YS组比较，YSHZ组初始角度数显著减少（P＜0.05）。③穿越平台次数：与SAMR1组比较，SAMP8、YS组穿越平台次数显著减少（P＜0.05），与SAMP8组比较，YSHZ、YS、HZ组穿越平台次数无显著差异（P＞0.05）。④目标象限路程占总路程比例：与SAMR1组比较，SAMP8、YS、HZ组目标象限路程所占比例显著减少（P＜0.05）；与SAMP8组比较，YSHZ组目标象限路程所占比例显著增加（P＜0.05）；与YS、HZ组比较，YSHZ组目标象限路程所占比例显著增加（P＜0.05）。
　　（2）尼氏染色和透射电子显微镜结果发现：①大体形态与微观结构：与SAMR1组比较，SAMP8组，神经元排列较为松散，尼氏体减少，有较多不规则形状和相对较小的死亡细胞，神经元缺失区域较多；细胞膜双层结构不完整，出现断裂；胞质中细胞器减少，线粒体双层膜结构不完整，嵴膜融合数量减少，线粒体基质减少，部分线粒体有明显肿胀，粗面内质网核糖体脱落明显，有较多空泡，存在包含脂褐素的次级溶酶体；细胞核出现固缩，较多区域出现核膜双层结构断裂，核仁不明显，染色质不均匀。益肾化浊方及拆方干预后，神经元排列较为紧凑，尼氏体较丰富、颜色深染；细胞膜完整、连续；胞质中细胞器较丰富，线粒体内、外膜连续性较好，嵴完整丰富，线粒体基质相对致密丰富，部分线粒体出现嵴膜损伤，粗面内质网丰富，高尔基体形态完整丰富，存在包含脂褐素的次级溶酶体；细胞核形态规则，轮廓清晰，双侧膜结构完整，部分区域出现膜断裂，核仁较明显，形态欠规整，染色质较均匀。②海马CA1区神经元数量：与SAMR1组比较，SAMP8、YSHZ、YS、HZ组神经元数量显著减少（P＜0.05）；与SAMP8组比较，YSHZ、YS组神经元数量显著增加（P＜0.05）；与YS、HZ组比较，YSHZ组神经元数量显著增加（P＜0.05）。
　　（3）海马区Aβ表达水平：①甘氨酸银浸染色显示，各组小鼠海马CA1区均未发现典型的老年斑；与SAMR1组比较，SAMP8组海马CA1区辐射层可见数量较多疏松分布的异常点簇状黑色斑点团，且丝状原纤维数量减少，交织密度降低。益肾化浊方及拆方干预后，点簇状黑色斑点团相对减少。②免疫组化显示，与SAMR1组比较，SAMP8、YSHZ、YS、HZ组Aβ表达量显著增加（P＜0.05）；与SAMP8组比较，YSHZ、YS、HZ组Aβ表达量显著减少（P＜0.05）；与HZ组比较，YSHZ组Aβ表达量显著减少（P＜0.05）。③Westernblot显示，与SAMR1组比较，SAMP8、YSHZ、YS、HZ组Aβ单体和Aβ寡聚体表达量显著增加（P＜0.05），与SAMP8组比较，YSHZ、YS、HZ组Aβ单体和Aβ寡聚体表达量显著减少（P＜0.05）。
　　（4）Westernblot检测结果发现，与SAMR1组比较，SAMP8组mTOR、p-mTOR蛋白表达和p-mTOR/mTOR比值显著增加（P＜0.05），PI3K3、Beclin1、p-Bcl-2蛋白表达显著减少（P＜0.05）；与SAMP8组比较，YSHZ、YS、HZ组p-mTOR蛋白表达和p-mTOR/mTOR比值显著减少（P＜0.05），YSHZ组PI3K3、Beclin1、p-Bcl-2蛋白表达显著增加（P＜0.05），HZ组PI3K3蛋白表达有增加趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　（5）透射电子显微镜结果显示，各组小鼠海马CA1区神经元胞质细胞核周围，均可观察到双层膜结构的自噬体，提示各组中均有自噬发生。Westernblot检测结果发现，与SAMR1组比较，SAMP8组Atg7、Atg12-Atg5复合体、LC3Ⅱ、VAMP8蛋白表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著减少（P＜0.05），p62蛋白表达量显著增加（P＜0.05）；与SAMP8组比较，YSHZ组Atg7、Atg12-Atg5复合体、LC3Ⅱ、VAMP8蛋白表达量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著增加（P＜0.05），p62蛋白表达量显著减少（P＜0.05）；YS组Atg12-Atg5复合体、LC3Ⅱ蛋白表达量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著增加（P＜0.05），p62蛋白表达量显著减少（P＜0.05）；HZ组p62蛋白表达量显著减少（P＜0.05），LC3Ⅱ蛋白表达量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值有增加趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。RT-PCR检测结果发现，与SAMR1组比较，SAMP8组p62mRNA表达量显著增加（P＜0.05）；与SAMP8组比较，YSHZ组p62mRNA表达量显著减少（P＜0.05）。免疫荧光双染显示，LAMP1和LC3Ⅱ结果，与SAMR1组比较，SAMP8组LC3Ⅱ阳性表达较弱，橙色共表达区域较少；与SAMP8组比较，YSHZ、YS、HZ组LC3Ⅱ阳性表达有所增强，橙色共表达区域有所增多。LAMP1和Aβ42结果，与SAMR1组比较，SAMP8组Aβ42阳性表达较强，橙色共表达区域较多；与SAMP8组比较，YSHZ、YS、HZ组Aβ42阳性表达有所减弱，YSHZ、YS组橙色共表达区域有所增多。
　　结论
　　（1）益肾化浊方可有效改善12月龄SAMP8小鼠学习和空间记忆能力减退，该作用与减少海马Aβ沉积、保护神经元微观结构、减轻神经元缺失有关。
　　（2）益肾化浊方可减少12月龄SAMP8小鼠海马自噬启动负调节因子活化，增加自噬体形成、转运及融合降解阶段中关键蛋白的表达，促进神经元自噬过程顺利进行，清除细胞内Aβ，进而减轻其毒性作用引发的神经元缺失。