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目的:从沙雷氏菌(Serratia sp.)CQMUS2中克隆铬还原酶T(Chromate reductase T,ChrT)的全基因序列,构建其原核表达载体pET-28a(+)-ChrT并转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中,通过诱导表达和亲和层析纯化,初步研究ChrT的酶活性及其对Cr(Ⅵ)的还原能力。 方法:采用RCR和高效热不对称交错PCR(High-efficiencythermal asymmetric interlaced PCR, hiTAIL-PCR)技术从Serratia sp.CQMUS2菌株中扩增ChrT全基因序列,测序并利用生物信息学软件分析其序列特征。将获得的ChrT基因与克隆载体pMD19-T及表达载体pET-28a(+)进行连接,并转化至宿主菌E.coli BL21(DE3),得到基因工程菌。利用IPTG诱导表达工程菌,观察ChrT在不同时间的表达水平;提取工程菌外周质、可溶物及包涵体成分经SDS-PAGE电泳观察重组蛋白的表达形式及定位分析;采用Ni-NTA柱纯化目的蛋白ChrT,利用辅酶NADPH在340nm处的吸光度值变化检测重组ChrT酶活性,同时根据反应体系中Cr(Ⅵ)变化情况评价ChrT酶对Cr(Ⅵ)的还原能力。 结果:从Serratia sp.CQMUS2菌株中克隆得到铬还原酶ChrT全基因序列,该基因序列长为567 bp,编码188 aa;多重序列比对及进化分析表明,其76%属于高度保守且与肺炎克雷伯菌亲缘关系最近;3D结构特征与已知的大肠杆菌铬还原酶ChrR相似度为85.6%。以该基因构建的基因工程菌pET-28a(+)-ChrT/BL21经IPTG诱导,表达产物随时间递增逐渐增加,10h后达最高;表达产物定位及可溶性分析发现该重组酶主要以可溶性成分存在于细胞质中;经Ni-NTA柱纯化的ChrT酶能利用辅酶NADPH,使得NADPH的A340在5 min内迅速下降94.5%; ChrT酶能还原酶促反应体系中的Cr(Ⅵ),使实验组Cr(Ⅵ)含量显著低于对照组(P=0.000),酶活性为164 U/mg。 结论:成功构建的基因工程菌pET-28a(+)-ChrT/BL21能够正确表达重组蛋白ChrT,且该酶具有Cr(Ⅵ)还原活性,为进一步研究高效除铬工程菌提供了菌种资源和基因资源。