【摘 要】
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目的:探究胃上皮细胞GES-1和胃腺癌细胞AGS感染幽门螺杆菌后自噬及线粒体功能的变化;研究MNNG及寡霉素与幽门螺杆菌协同诱导GES-1细胞恶性转化时,幽门螺杆菌及线粒体功能在GES-1细胞恶性转化中的作用,从而为揭示幽门螺杆菌在诱导细胞恶性转化过程中的的具体致病机制提供新思路。方法:幽门螺杆菌CagA阳性菌株与正常胃上皮细胞GES-1共培养6h,Western blot检测HK2及LC3B-Ⅱ
【基金项目】
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国家科学自然资金项目（No.81771709，No.81471561）；
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目的:探究胃上皮细胞GES-1和胃腺癌细胞AGS感染幽门螺杆菌后自噬及线粒体功能的变化;研究MNNG及寡霉素与幽门螺杆菌协同诱导GES-1细胞恶性转化时,幽门螺杆菌及线粒体功能在GES-1细胞恶性转化中的作用,从而为揭示幽门螺杆菌在诱导细胞恶性转化过程中的的具体致病机制提供新思路。方法:幽门螺杆菌CagA阳性菌株与正常胃上皮细胞GES-1共培养6h,Western blot检测HK2及LC3B-Ⅱ的表达;HK2经siRNA干扰后感染幽门螺杆菌CagA阳性菌株,检测LC3B-Ⅱ及ROS的表达;ROS清除剂NAC消除GES-1细胞内ROS后,检测LC3B-Ⅱ的表达。幽门螺杆菌CagA阳性菌株和幽门螺杆菌CagA阴性菌株分别与GES-1和AGS细胞共培养6h,就两种细胞线粒体内LC3B-Ⅱ、VDAC、MFN2 及 FIS1 的表达情况采用 Western blot 检测;Western blot与免疫荧光检测两种细胞COXIV的表达;两种细胞线粒体ATP的产生情况以荧光法检测,流式细胞术及荧光法分析两种细胞线粒体膜电位,透射电镜实验观察GES-1细胞内线粒体形态与数量;就AGS细胞的增殖、凋亡、侵袭与迁移情况,分别采用CCK8法、流式细胞术、结晶紫染色实验来检测。幽门螺杆菌CagA阳性菌株和幽门螺杆菌CagA阴性菌株分别协同MNNG及寡霉素诱导GES-1细胞恶性转化,共培养至第4周末,吉姆萨染色观察细胞染色体畸变,细胞周期与细胞凋亡情况用流式细胞术检测;细胞侵袭水平用结晶紫染色观察,细胞增殖能力以CCK8检测;细胞划痕实验观察细胞迁移。结果:（1）CagA阳性幽门螺杆菌感染GES-1细胞时,增强细胞内HK2及LC3B-Ⅱ的表达;siRNA沉默HK2,CagA 阳性幽门螺杆菌感染增强GES-1细胞LC3B-Ⅱ和ROS表达;NAC清除ROS,降低GES-1细胞内LC3B-Ⅱ表达。由此提示,沉默HK2,增强CagA阳性幽门螺杆菌诱导的GES-1细胞自噬。（2）两株幽门螺杆菌感染GES-1细胞时,均增强细胞内线粒体LC3B-Ⅱ的表达,降低COXIV及VDAC的含量;抑制ATP的产生,削弱MFN2的表达,对FIS1的含量及线粒体膜电位无影响。经上述分析可知:幽门螺杆菌感染促进GES-1细胞线粒体自噬,加速线粒体降解,CagA在其中发挥负性调控作用;幽门螺杆菌感染抑制GES-1细胞产能,CagA在其中不发挥作用;幽门螺杆菌感染在CagA的负性调节下下调GES-1细胞融合能力。同时,幽门螺杆菌感染不改变GES-1细胞线粒体分裂及膜电位。（3）两株幽门螺杆菌感染AGS细胞时,均增强细胞内线粒体LC3B-Ⅱ的表达;降低MFN2的含量,FIS1、COXIV及VDAC的含量无明显变化;抑制线粒体膜电位,不影响线粒体产生ATP的水平。提示幽门螺杆菌在CagA的正性调控下,增强线粒体自噬,抑制线粒体膜电位;减弱细胞融合活动,受CagA负性调节;对线粒体分裂、产能及数量没有显著影响。此外,幽门螺杆菌在CagA不发挥作用的情况下促进AGS细胞凋亡、抑制细胞增殖;在CagA的负性调控下抑制AGS细胞侵袭与迁移。（4）在MNNG联合应用下,两株幽门螺杆菌感染及线粒体功能障碍诱导正常胃上皮细胞GES-1恶性转化,具体表现为在CagA的正性调控下增强细胞增殖、侵袭、迁移能力,增加染色体畸变率,抑制细胞凋亡。结论:幽门螺杆菌感染增强自噬,破坏线粒体正常功能,导致线粒体功能障碍从而影响细胞稳态,促进细胞恶性转化,其机制受CagA影响。
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