研究背景:创面愈合是一个动态变化、精细调控的生物学过程,包括炎症期、增殖期和重塑期,各期顺序发生并彼此影响。成纤维细胞是参与创面愈合过程中的重要成员,由于其在肉芽组织形成中的核心作用,他的迁移和增殖是创面修复的关键步骤。如果肉芽组织形成失调,创面可能会延迟或无法愈合。创面形成后,内外源刺激开始激活各种细胞,为创面愈合创造条件。虽然炎症微环境已被证实是创面愈合的关键始动环节,并且成纤维细胞在这一过程中发挥了重要作用,但它们之间的相关性和潜在的调控机制并不十分清楚。所以,深入了解真皮成纤维细胞在炎症作用下如何调节创面修复的过程是有必要的。微管是由α/β微管蛋白异二聚体构成的动态聚合物,属于细胞骨架的重要部份。微管蛋白的解聚和聚合之间的动态转换被称之为是微管动力学,受微管解聚蛋白（如stathmin家族）和微管稳定蛋白（如微管相关蛋白家族）所调控。微管动力学变化可以导致不同的细胞生物学行为发生。既往研究表明,微管解聚导致表皮或肿瘤细胞迁移和增殖增加;相反,微管聚合抑制细胞迁移和增殖。然而,一些相互矛盾的研究也表明微管稳定促进肿瘤细胞的侵袭。因此,有必要深入探讨微管动力学和细胞迁移及增殖之间的关系。Stathmin是一种微管解聚蛋白,通过与微管蛋白二聚体结合促进微管解聚。stathmin表达增加后,微管解聚,反之,stathmin表达减少后,微管聚合。Stathmin细胞增殖包括从间期到有丝分裂期的全过程。细胞质微管调节蛋白,如stathmin家族,在细胞周期调控中发挥重要作用。近年来的研究指出,在高度增殖的神经母细胞瘤细胞或胃癌细胞中观察到stathmin表达增加。此外,多种信号转导通路参与调节stathmin,这其中包括MAPKs、微管亲和调节激酶和蛋白激酶A。既往研究表明p38/MAPK激活可调节心肌细胞stathmin表达,同时,p38/MAPK激活还可以通过调节stathmin影响胆囊癌细胞和炎症细胞的增殖和迁移。然而,stathmin是否参与创面愈合过程中炎症诱导真皮成纤维细胞迁移和增殖的作用及机制仍不清楚。在本研究中,我们旨在探索stathmin在炎症介导下真皮成纤维细胞迁移和增殖中的作用,以期为临床干预创面治疗提供潜在靶点。材料及方法:1.采用真皮成纤维细胞（Human dermal fibroblast,HDFs）和脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）模拟细胞炎性模型。用7种浓度（0、5、10、50、100、500、1000ng/ml）的LPS处理细胞24h,通过划痕试验观察细胞迁移情况。接下来,我们选择以CCK-8法检测LPS（500ng/ml）在4个时间点（0h,12h,24h,48h）对HDFs增殖的影响,筛选模拟细胞炎性模型最适宜的LPS浓度和作用时间;2.根据前面筛选的模拟细胞炎性微环境的LPS作用条件刺激HDFs,然后通过细胞划痕试验观察HDFs迁移的变化,以CCK-8、Edu、western blot检测细胞增殖情况,使用免疫荧光染色观察微管结构的改变。3.根据前面筛选的模拟细胞炎性微环境的LPS作用条件刺激HDFs。然后使用taxol（一种微管稳定剂）干预后,观察细胞迁移变化;利用CCK-8、Edu、western blot检测细胞增殖情况,以及免疫荧光染色法观察微管结构的改变HDFs来判断微管与真皮成纤维细胞迁移增殖之间的关系。4.通过检测小鼠创面形成3天后stathmin的表达,验证创面愈合过程中,stathmin炎症反应中的重要性。然后通过前期筛选的LPS处理条件模拟炎症微环境,检测HDF的stathmin表达情况;随后用si STMN（si RNA靶向干扰stathmin）干扰stathmin表达,使用划痕实验检测细胞迁移,CCK-8、Edu、western blot检测细胞增殖情况,以及免疫荧光染色法观察微管结构的改变。来探明stathmin在LPS诱导炎症微环境促进HDFs迁移和增殖中的作用。5.通过检测小鼠创面形成3天后p38/p-P38的表达,验证创面愈合过程中,p38/p-P38在炎症反应中的重要性。然后通过前期筛选的LPS处理条件模拟炎症微环境,通过免疫印迹检测HDF的p38激活情况;然后使用SB203580（p38抑制剂）、CMV（null）、MKK6（p38上游激酶）、si NC、si STMN处理细胞,同前使用的方法检测细胞迁移和增殖的变化,以及免疫荧光观察微管结构的变化;探索p38/p-P38是否是通过调控stathmin表达来参与并且影响LPS诱导的HDFs迁移增殖和微管解聚。结果:1.通过预实验筛选出LPS浓度为500ng/ml处理24小时构建细胞炎症模型。LPS（0、5、10、50、100、500、1000ng/ml）在不同浓度作用于HDFs后,HDFs的迁移呈浓度依赖性增加并且在浓度为500ng/ml时迁移最快,进一步选取500ng/ml的LPS在不同时间点（0、12、24、48小时）刺激细胞,结果发现,处理24h时,细胞增殖较对照组增加最为显著;故选择LPS（500ng/ml）作用24h刺激HDFs用于后续实验。炎症模型构建成功后,进一步检测了HDFs的迁移和增殖情况,发现LPS组较对照组显著增加。并且LPS处理HDFs后,微管解聚更为明显。这些结果提示,适度的炎症刺激促进HDFs迁移、增殖和微管解聚。2.基于上述实验,我们筛选出LPS最佳处理条件（500ng/ml,24h）用于后续实验。结果发现,使用taxol（一种微管稳定剂）提前处理细胞1h后,细胞迁移和增殖较对照组无明显改变,但微管密度增加,解聚减少;而LPS+紫杉醇组的迁移和增殖较LPS组受到显著抑制,并且微管解聚明显减少。3.创面形成3天后,创缘组织中stathmin的表达含量较对照组显著增高;同时,LPS刺激后stathmin表达增加,而应用si STMN转染HDFs可以抑制LPS诱导的HDFs迁移和增殖;同时,si STMN转染HDFs后,不仅增加微管密度,减弱微管的解聚作用,而且能够抑制LPS诱导的炎症微环境对HDFs微管解聚作用。4.创面形成3天后,创缘组织中p38/MAPK表达含量较对照组增高;LPS刺激HDFs后,p-P38增加,而抑制该通路后,p-P38表达下降并且stathmin表达水平降低;并且,应用SB203580能够抑制LPS促进HDFs迁移增殖增加以及微管解聚;使用CMV（null）、MKK6、si NC、si STMN处理细胞,结果发现,MKK6组促进HDFs迁移增殖和微管解聚,而应用si STMN能够阻断该效应,表明p38/MAPK激酶通路通过调节stathmin表达从而介导LPS诱导的HDFs迁移增殖和微管解聚。结论:我们的研究结果表明,在创面愈合过程中,stathmin在脂多糖诱导的炎症促进真皮成纤维细胞迁移和增殖中发挥了重要作用,而p38/MAPK作为stathmin介导微管解聚的上游激酶,近一步调控着真皮成纤维细胞的迁移增殖。