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研究背景癌症是世界范围内的主要死亡因素,放化疗依旧是大多数实体瘤治疗的首选方式。然而,乏血乏氧是大多数肿瘤化疗失败的共同特征。近年来,大量研究表明超声激励微泡空化产生声孔效应可以促使微血管内皮舒张,增强肿瘤血流灌注促进化疗药物释放的同时抑制肿瘤生长。本课题组前期的研究结果发现,MI为0.3时,超声激励微泡空化（Ultrasound stimulated microbubble,USMB）可显著增强肿瘤超声造影（Contrast-enhanced ultrasound,CEUS）峰值强度（Peak intensity,PI）和曲线下面积（Area under the curve,AUC）,增加肿瘤血供;脉冲重复频率为1.0KHz,低强度超声激励微泡空化亦可增强肿瘤血供促进化疗药物释放。然而,不同脉冲宽度（Pulse length,PL）和脉冲重复频率（Pulse repitition frequency,PRF）组合超声激励微泡空化对肿瘤血供的影响仍是未知。本次实验采用机械指数（Mechanical index,MI）和占空比固定的情况下,研究不同脉冲宽度和脉冲重复频率组合超声激励微泡空化对肿瘤血供及化疗药物阿霉素（Doxorubicin,Dox）释放、肿瘤生长抑制和小鼠生存期的影响。研究目的1.通过设置固定的占空比和机械指数,研究不同超声参数组合对肿瘤血流灌注的影响。2.进一步研究不同脉冲宽度和脉冲重复频率组合改变肿瘤血流灌注对化疗药物释放的影响。3.在前期研究的基础上,观察不同脉冲宽度和脉冲重复频率组合超声激励微泡空化联合化疗药对肿瘤生长抑制及小鼠生存期的影响。材料和方法1.主要实验仪器VINNO 70超声诊断治疗一体仪（飞依诺科技有限公司,苏州）,X4-12L高频线阵探头,频率为4～12 MHz。超声诊断治疗一体仪其治疗功能可通过Vflash功能调节机械指数、中心频率、脉冲宽度、脉冲重复频率等参数调控微泡空化,改善肿瘤血流灌注。2.主要实验试剂（1）脂氟显:陆军军医大学新桥医院超声科研制,核心气体为全氟丙烷,冻干法制得,肿瘤超声治疗及造影时使用。本次实验中微泡原液浓度为（2～9）×10~9/ml,超声造影时微泡浓度为（2～9）×10~9/m L,治疗时微泡原液用生理盐水稀释至浓度为（2～9）×10~6/ml。（2）盐酸多柔比星:（美仑科技有限公司,大连）3.实验动物C57BL/6小鼠80只,6～8周龄,体重17～20 g。购买于北京华阜康生物科技有限公司[许可证号:SCXK（渝）20170002],本次实验过程中所有动物操作和治疗均通过陆军军医大学实验动物福利伦理委员会审核（AMUWEC20213009）。4.实验方法与结果建立模型:鼠源性结直肠癌MC-38细胞复苏、传代,建立细胞悬液,将细胞浓度调整为（3～5）×10~7/ml,随机选取小鼠背部一侧备皮、消毒,皮下注射130ul,轻轻按压45s。游标卡尺测量肿瘤最大径约为0.6cm时,将小鼠纳入实验。实验一:超声不同脉冲宽度和脉冲重复频率组合激励微泡空化增强肿瘤的血流灌注（1）实验方法:将32只C57BL/6荷瘤鼠随机分为4组,每组8只。在手术前,动物通过腹腔注射2.0%三溴乙醇（0.015 ml/g）,建立尾静脉通道。本次实验中MI约等于0.28,占空比约为0.20%,余各组超声治疗参数设置如下:对照组（A组）,PL6.5+PRF1000组（B组）,PL3.0+PRF2000组（C组）,PL34.5+PRF200组（D组）。各组治疗前后储存60s造影录像。（2）测量指标:治疗前后肿瘤超声造影的曲线下面积值、峰值强度值,肿瘤血流灌注面积值。（3）实验结果:治疗后,A组肿瘤组织曲线下面积值、峰值强度值及肿瘤灌注面积与治疗前相比无明显差异（P＞0.5）;B、C组肿瘤曲线下面积值和峰值强度值、肿瘤血流灌注面积值较治疗前均增加,D组治疗后肿瘤曲线下面积值和峰值强度值、肿瘤血流灌注面积值较治疗前明显下降,差异均有统计学意义（P＜0.5）。实验二:超声不同脉冲宽度和脉冲重复频率组合激励微泡空化对肿瘤化疗药物释放的影响（1）实验方法:将24只C57BL/6荷瘤鼠随机分为4组,每组6只。4组实验参数设置及处理方法同试验一。实验一和实验二治疗结束后,10min内经尾静脉按0.01mg/g体质量缓慢匀速推注阿霉素1mg/ml DOX,推药结束20min后处死实验鼠。（2）测量指标:试验一中肿瘤组织用高效液相方法定量检测阿霉素药物浓度,试验二中肿瘤组织包埋切片后,激光共聚焦定性检测阿霉素荧光强度,每组随机取小鼠肿瘤组织进行透射电镜（Transmission electron microscopy,TEM）及病理切片分析,用于观察肿瘤组织微血管改变。（3）实验结果:B组和C组阿霉素药物浓度分别是A组的3.15和4.8倍,差异均有统计学意义（P＜0.5）;D组阿霉素药物浓度与A组相比无明显差异（P＞0.5）。B组和C组阿霉素荧光强度较A组分布更广更均匀,B组和C组阿霉素荧光强度分别是A组的2.73和4.49倍,差异均有统计学意义（P＜0.5）;D组激光共聚焦阿霉素荧光强度与A组相比无明显统计学差异。B组和C组透射电镜及病理切片可见肿瘤组织微血管扩张,内皮细胞轻度水肿,D组可见血管破裂塌陷,红细胞漏出。实验三:超声不同脉冲宽度和脉冲重复频率组合激励微泡空化联合化疗药对肿瘤生长抑制及生存期的影响（1）实验方法:将24只C57BL/6荷瘤鼠随机分为4组,每组6只。肿瘤组织最大径＞0.6cm时开始治疗,4组实验参数设置及处理方法同试验一。分别于1th,4th,7th天治疗,每次治疗后分别给予阿霉素化疗。（2）测量指标:用超声测量1st,4th,7th天肿瘤大小,记录小鼠生存期。（3）实验结果:治疗前各组间荷瘤鼠体质量和肿瘤大小无明显统计学差异;第4天时,C组肿瘤生长率明显低于A组和D组（P＜0.01;P＜0.05）;B组肿瘤生长率明显低于A组（P＜0.05）;A组和D组间肿瘤生长率没有明显统计学差异（P＞0.05）;B组和C组间肿瘤生长率没有明显统计学差异（P＞0.05）。第7天时,C组肿瘤生长率明显低于A组和D组（P＜0.01;P＜0.05）;B组肿瘤生长率明显低于A组（P＜0.05）;A组和D组间肿瘤生长率没有明显统计学差异（P＞0.05）;B组和C组间肿瘤生长率没有明显统计学差异（P＞0.05）。C组荷瘤鼠存活率高于其它三组,然而各组间小鼠生存期无明显统计学差异。5.结论1.不同脉冲宽度和脉冲重复频率组合联合微泡可改变肿瘤血供,较高脉冲重复频率和较短脉冲宽度组合可增强肿瘤血供,较高脉冲宽度和较低脉冲重复频率并不能增强肿瘤血供。2.超声联合微泡增强肿瘤血供可增加肿瘤局部化疗药物阿霉素的浓度。3.较高脉冲宽度和较低脉冲重复频率组合激励微泡空化可使肿瘤微血管内皮细胞肿胀,血管腔坍塌,红细胞漏出于肿瘤间质。4.较高脉冲重复频率和较低脉冲宽度组合联合微泡可抑制肿瘤生长。然而,对荷瘤鼠生存期不具有明显影响。