论文部分内容阅读
富含甘氨酸和脯氨酸的蛋白(glycine and proline-rich protein,GPRP)基因广泛分布于植物界中,且已被证实在植物的生长发育和逆境适应过程中扮演着非常重要的角色。然而,目前仅在少数几种植物中对其基因结构特征、表达特性和功能预测等进行了初步报道,水稻中有关这类家族基因的研究鲜有报道。 本研究克隆了3个候选的水稻OsGPRP基因,结合生物信息学分析手段,对这3个OsGPRP基因的结构特征进行了分析;基于荧光定量PCR等方法对正常和逆境下OsGPRP家族基因在水稻不同组织部位的表达模式进行了分析;利用烟草叶片瞬时表达法对预测的OsGPRP蛋白进行了初步的亚细胞定位分析。此外,还对OsGPRP1和OsGPRP3蛋白进行了原核表达分析;利用pCXUN质粒构建了OsGPRP1和OsGPRP2基因的过量表达载体,以农杆菌介导法转化水稻,获得了转基因T2代植株。为进一步研究水稻OsGPRP家族基因的生物学功能奠定了基础。主要研究结果如下: 1.水稻OsGPRP家族基因结构特征分析 借助生物信息学分析手段,成功筛选并克隆了3个水稻OsGPRP家族基因;3个水稻OsGPRP基因含有2-3个外显子和1-2个内含子,编码170-197个氨基酸,蛋白大小为16.8-19.7kDa,等电点为7.53-9.82;启动子中含有多种逆境响应元件;蛋白序列结构特征分析表明,3个OsGPRP含有典型的植物GPRP蛋白保守结构域(N端XYPP重复序列、中部富含A的疏水区和C端HGK重复区),符合植物GPRP蛋白家族的结构特征。系统进化树分析结果显示,OsGPRP1和OsGPRP3属于同一分枝,OsGPRP2属于另一分枝。 2.正常和逆境下OsGPRP基因在水稻不同组织部位中的表达模式 荧光定量PCR结果显示,正常情况下3个OsGPRP基因在水稻幼苗的根、茎、叶和抽穗期的幼穗中存在差异表达,均在叶中表达量最高;在低温、干旱和高盐逆境下,3个OsGPRP基因在水稻不同组织部位中的表达模式存在明显差异,OsGPRP2和OsGPRP3在根和茎中均显著上调表达,OsGPRP1和OsGPRP2在叶中下调表达;在干旱胁迫下,OsGPRP1基因在水稻根中显著上调表达;在盐胁迫下,OsGPRP3在叶中显著上调表达。 3.水稻OsGPRP蛋白亚细胞定位分析 分别成功构建了3个OsGPRP家族蛋白与GFP蛋白融合表达载体,利用农杆菌介导法进行了烟草叶片瞬时表达,荧光显微镜观察结果显示,OsGPRP1和OsGPRP3蛋白可能在细胞核、细胞膜和各种细胞器膜中均有表达,而OsGPRP2蛋白可能主要在细胞核中表达。 4.OsGPRP1和OsGPRP3蛋白的原核表达 成功构建了水稻OsGPRP1和OsGPRP3蛋白的原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功诱导表达了OsGPRP1和OsGPRP3蛋白;为探究水稻OsGPRP蛋白的性质与功能奠定了基础。 5.OsGPRP1和OsGPRP2过量表达转基因T2代水稻植株的获得 利用pCXUN质粒成功构建了水稻OsGPRP1和OsGPRP2基因过量表达载体,采用农杆菌介导法成功转化粳稻中花11,目前已获得了OsGPRP1和OsGPRP2过量表达转基因水稻T2代纯合植株各1个株系,为深入研究这2个基因的生物学功能奠定了基础。