结直肠癌是目前最常见的恶性肿瘤之一,其主要来源于腺瘤。全球每年结直肠癌的新增病例超过100万人,其中约有一半患者因此而死亡。目前外科手术仍是治疗结直肠癌最有效的方法,但是30%的患者在确诊时已处于中晚期,错过了手术治疗的最佳时期。对于不能手术的患者,目前采用的主要方法是化学治疗、放射治疗、有时结合局部微创的介入治疗等。近年来随着外科手术技能的提高及放化疗手段的快速进展,结直肠癌的疗效得到了很大改善。但是,目前结直肠癌仍是世界范围内恶性肿瘤患者死亡的主要原因之一,究其原因,主要是由于结直肠癌的高复发率和转移率。恶性肿瘤的发生发展与癌基因的表达增加或者抑癌基因的表达下调密切相关。在结直肠癌中,一些癌基因和抑癌基因的调节发生了异常,从而在肿瘤发生发展过程中起重要作用。进一步了解这些基因在肿瘤生物学中的作用机制,对于临床治疗效果的预测以及发现新的治疗策略具有重要意义。神经导向因子SLIT2基因位于第4p15.2号染色体,是一种分泌型糖蛋白,通过与其受体ROBO1结合参与细胞信号转导。一般情况下,SLIT2/ROBO1信号通路主要通过调控Rho-GTPases Racl和cdc42的活性参与神经元迁移调节。有文献报道SLIT2在新生血管的形成中具有重要作用。最近的研究发现SLIT2及其下游信号通路在多种肿瘤中均发生异常。在肝癌、宫颈癌、肺癌和乳腺癌中,SLIT2的表达量降低,这种由于启动子甲基化引起的表达抑制与细胞的恶性转化有关。在神经胶质瘤中,SLIT2的表观失活导致RhoGTPase的异常激活,促进肿瘤的迁移和浸润。另外,在纤维肉瘤和鳞状细胞癌中,SLIT2能够通过调控Bcl-2. Cdk6以及其他与凋亡和增殖相关的基因的表达抑制肿瘤的生长和转移。SLIT2表观沉默与结直肠癌的异常生长也有关系。大概72%的结直肠癌SLIT2启动子区域发生了甲基化,并且在结直肠癌早期阶段就存在SLIT2基因缺失。采用去甲基化试剂处理能够使结直肠癌细胞中SLIT2的甲基化状态发生逆转,恢复正常表达。外源表达的SLIT2能够抑制结直肠癌细胞的克隆形成能力。但是,也有研究发现,在表达ROBO1的结直肠癌细胞中,增加SLIT2蛋白的表达量能够募集泛素连接酶Hakai,引起E-cadherin泛素化和溶酶体降解,促进上皮细胞-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)的发生,从而导致肿瘤的生长和转移。以上的研究说明,SLIT2在结直肠癌中的作用非常复杂。为了进一步阐明SLIT2在结直肠癌发生发展中的作用及机制,本研究中,我们通过对临床不同分期的结直肠癌样本进行检测,分析了SLIT2表达与结直肠癌临床病理特性之间的关系,并对SLIT2在结直肠癌转移中的作用及其相关机制进行了探索。结果发现SLIT2的表达与结直肠癌的进展程度呈负相关,SLIT2蛋白的增加能够减弱结直肠癌细胞系SW480细胞的迁移能力,而SLIT2基因的敲除则引起NCM细胞EMT的发生,并促进细胞的侵袭迁移；进一步的研究表明,SLIT2对肿瘤转移的抑制作用受AKT-GSK3β信号通路的调控。第一部分SLIT2表达与结直肠癌转移之间的关系研究目的：探索SLIT2的表达是否与结直肠癌转移相关。方法：应用q-PCR法检测了SLIT2 mRNA,免疫组化法检测了SLIT2蛋白和β-catenin蛋白在转移性和非转移性结直肠癌组织中的表达情况；结果：SLIT2 mRNA在Duke C期和D期转移性结直肠癌组织中表达明显受到抑制；SLIT2蛋白和SLIT2受体蛋白ROBO1在转移性结直肠癌组织中的表达也显著下调；同时P-catenin在转移性结直肠癌组织中的表达同步发生上调。结论：SLIT2表达下调与结直肠癌转移相关,并且可能有P-catenin的参与。第二部分SLIT2对结直肠癌细胞侵袭迁移的抑制作用研究目的：探索SLIT2对结直肠癌细胞侵袭迁移的影响。方法：利用结直肠癌细胞和正常结肠上皮细胞模型,通过添加外源SLIT2蛋白或转染SLIT2表达质粒使SLIT2在细胞中过表达,或者采用RNAi的方法抑制SLIT2的表达,结合细胞创伤愈合实验和Transwell实验分析研究了SLIT2对结直肠癌细胞侵袭迁移的影响；结果：细胞创伤愈合实验显示,增加外源SLIT2蛋白能够显著降低SW480细胞创伤愈合的速度,说明其能够抑制SW480细胞的能动性。通过脂质体转染的方法将SLIT2表达质粒转染至SW480细胞中,使SLIT2在SW480细胞中过表达,创伤愈合实验结果显示,同增加外源SLIT2一样,过表达SLIT2的SW480细胞的创伤愈合速度明显下降,说明SLIT2对SW480细胞迁移的影响是通过细胞自主方式进行的。通过RNAi的方法抑制NCM460细胞中SLIT2的表达后,细胞创伤愈合的速度增快。同样,Transwell分析显示,SLIT2蛋白表达缺失后,NCM460细胞穿过基膜的数量明显增加；而过表达SLIT2蛋白后,SW480细胞穿过基膜的数量显著减少。结论：SLIT2过表达能够抑制结直肠癌细胞的侵袭迁移,而表达缺失后结肠上皮细胞的迁移能力增强,说明SLIT2在结直肠癌转移中起重要作用。第三部分SLIT2在结直肠癌上皮-细胞间质转化中的作用研究目的：探索SLIT2在结直肠癌EMT过程中的作用。方法：通过增加外源SLIT2或者RNAi抑制SLIT2表达构建细胞模型,结合western blot和免疫荧光分析研究了SLIT2对EMT中的关键蛋白表达的影响；结果：SW480细胞中,过表达SLIT2导致Snail表达下降,引起EMT过程中的关键分子E-cadherin的表达水平上调。NCM460细胞中,抑制SLIT2的表达后,Snail和P-catenin的表达增加,而E-cadherin表达则明显下降；另外,SLIT2抑制后间质标志蛋白N-cadherin和vimentin的表达也发生上调。免疫荧光实验显示,NCM460细胞中SLIT2表达受到抑制后,大量β-catenin从细胞质膜转位至细胞质和细胞核中。结论：SLIT2表达缺失能够导致结直肠癌细胞EMT的发生。第四部分SLIT2抑制结直肠癌细胞侵袭迁移的分子机制研究目的：探讨SLIT2引起结直肠癌细胞侵袭迁移抑制的相关分子机制。方法：利用NCM460细胞株,通过RNAi抑制SLIT2的表达后用AKT抑制剂triciribine进行处理,Transwell分析研究了AKT抑制对SLIT2缺失引起的结直肠癌细胞迁移的影响；通过RNAi抑制SLIT2的表达后用AKT抑制剂triciribine进行处理,收集细胞蛋白western blot检测p-AKT, p-GSK3β, Snail, E-cadherin的表达变化。结果：Transwell分析显示,AKT抑制剂处理后,SLIT2缺失引起的结肠上皮细胞迁移能力的增强受到抑制；在NCM460细胞中抑制SLIT2的表达后,p-AKT, p-GSK3β, Snail的表达水平上调,E-cadherin的表达下降；AKT抑制剂处理后,由于SLIT2缺失引起的上述各蛋白表达的变化得到逆转。结论：SLIT2通过AKT-GSK3p信号通路调控EMT过程抑制结直肠癌的侵袭迁移。