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研究背景与目的肝内胆管细胞癌是一种原发性胆道癌症,尽管不如其他肿瘤一样常见,但生物学行为比肝细胞肝癌更容易出现淋巴和远处转移,具有极高病死率,而且这几年它的发病率还在不断的上升。尽管部分患者能够进行根治性手术切除,但预后效果仍不是十分理想,患者在2年内的复发率极高。所以需要我们进一步对肝内胆管癌的分子学机制进行研究,寻找潜在的靶向治疗位点,这样才可能明显改善临床预后。PSMD10基因在很多肿瘤中存在高表达,被认为是一种新的原癌基因。在肝内胆管癌的肿瘤组织和细胞系中也发现该基因存在过表达,胆管癌的组织分化、TNM分期和转移与其密切相关。PSMD10基因可能在肝内胆管细胞癌的生长转移过程中发挥重要的作用,具有成为胆管细胞癌基因治疗的可能靶点。在本研究中,我们进一步明确PSMD10基因对肝内胆管癌的影响,并筛选到能够直接靶向调控PSMD10基因的mi R-605,初步探索二者在肝内胆管癌生长转移中的作用及可能的分子机制。材料与方法1、构建PSMD10 sh RNA的表达质粒,转染至胆管癌QBC939和RBE细胞株中。通过半定量PCR和Western blot来检测质粒转染的效率;通过MTT和软琼脂平板克隆形成实验检测胆管癌细胞的增殖情况;通过Transwell细胞小室实验评估胆管癌细胞的侵袭能力;测定细胞凋亡的情况。2、利用生物信息学软件筛选可能靶向调控PSMD10的mi RNAs,构建mi RNAs过表达质粒,转染至RBE细胞中,检测PSMD10的表达情况,进行初步筛选;在临床样本中检测初筛后的mi RNAs在癌组织和正常组织中的表达情况,进行二次筛选;最后,利用双荧光酶报告系统验证筛选出的mi RNA同PSMD10的靶向关系。3、转染筛选出的mi RNA过表达质粒至QBC939和RBE细胞中,通过MTT、软琼脂克隆形成、Transwell细胞小室实验检测胆管癌细胞的增殖和侵袭能力,利用动物体内成瘤实验验证筛选出的mi RNA是否能够抑制胆管细胞癌的生长和转移。4、在转染筛选出的mi RNA过表达质粒的QBC939和RBE细胞中过表达PSMD10,通过回复实验,利用软琼脂克隆形成、Transwell细胞小室实验明确m RNA的抑制作用是否依赖于PSMD10的表达。在RBE细胞中过表达P53,同时在过表达P53的REB细胞中转染mi RNA ASO,利用荧光定量PCR和western blot方法检测目标mi RNA和PSMD10的表达水平,初步探索可能存在的信号通路。结果1、沉默PSMD10基因的表达能够促进胆管癌细胞的凋亡,抑制胆管癌细胞的增殖和侵袭;2、利用生物信息学筛选到可能靶向PSMD10基因的mi R-559、mi R-605、mi R-875-3p和mi R-1254;转染后检测发现mi R-605和mi R-875-3p能够显著降低PSMD10的表达水平;在临床样本中的验证结果显示mi R-605与PSMD10具有负相关;二者的靶向调控关系通过双荧光素酶报告实验证实。3、体外细胞学实验,mi R-605的过表达能够促进细胞凋亡,显著抑制胆管细胞癌的增殖和侵袭;体内动物实验,mi R-605的过表达显著抑制了皮下种植肿瘤的生长。4、mi R-605对胆管细胞癌的抑制作用依赖于PSMD10;PSMD10参与了P53-mi R-605信号通路。结论mi R-605通过靶向调控PSMD10表达在肝内胆管癌的生长和转移中发挥了重要的作用,P53-mi R-605-PSMD10可能是肝内胆管癌中一条信号通路。