抗菌肽CGA-N12对热带念珠菌线粒体通透性转换孔作用机理研究

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抗菌肽CGA-N12是源于人嗜铬粒蛋白A的N-末端(CGA 65-76)衍生肽,具有特异抗念珠菌活性,对哺乳动物细胞无毒性。前期研究发现,CGA-N12诱导线粒体膜电位耗散,但其降低线粒体膜电位的机制尚不清楚。线粒体膜通透性转换孔(mPTP)是线粒体活性调节中枢,研究CGA-N12对mPTP的作用,旨在揭示CGA-N12降低线粒体膜电位作用机理。透射电镜和光谱学研究结果显示,CGA-N12改变线粒体超微结构,诱导基质肿胀,证明线粒体膜通透性增加;1500Da以下的物质自由进出线粒体,促进细胞色素c(Cyt c)和Ca2+释放,说明CGA-N12使mPTP不可逆开放;质子梯度消失,膜电位耗散,从而引起线粒体ATPase水解活性增加,加重mPTP的开放。结果表明,CGA-N12通过打开mPTP,降低热带念珠菌线粒体膜电位。利用不同作用机制的mPTP打开抑制剂环孢菌素A(CsA)、米酵菌素(BA)、溴二胺(MBM+)和二硫苏糖醇(DTT),研究CGA-N12在mPTP蛋白质复合物上的作用位点。光谱学结果表明,BA和MBM+完全阻止、DTT部分阻止CGA-N12造成的mPTP开放。结果表明,CGA-N12通过影响腺嘌呤核苷酸转运酶(ANT)的基质(m)构象,通过诱导产生的ROS维持线粒体内膜膜间表面mPTP蛋白质复合物上硫位点的交联以及mPTP蛋白质复合物上一些游离-SH的氧化打开mPTP。为阐明CGA-N12对念珠菌细胞作用的特异性,对比热带念珠菌和哺乳动物mPTP主要组成蛋白基因的不同,以人正常肝细胞L02和热带念珠菌基因组DNA为模板,对各蛋白基因的保守序列进行PCR扩增。结果发现,以哺乳动物细胞mPTP组成蛋白的基因保守区引物扩增热带念珠菌基因组DNA,没有扩增出BAX、Bcl-2基因,但能扩增出CyPD、VDAC I~III亚型和ANT I~IV亚型基因;以真菌mPTP组成蛋白的基因保守区引物扩增L02细胞基因组DNA,扩增出CyPD、VDAC基因。结果表明,热带念珠菌基因组DNA没有BAX、Bcl-2蛋白基因,含有CyPD,VDAC和ANT蛋白基因,且含有人CyPD,VDAC I~III亚型、ANT I~IV亚型的基因保守区引物的扩增位点;L02细胞基因组DNA含有真菌CyPD、VDAC引物的扩增位点,没有真菌ANT引物的扩增位点。研究结果初步表明,念珠菌与哺乳动物mPTP组成不同,其蛋白质的具体差异有待进一步研究。综上所述,CGA-N12通过破坏ANT基质构象,利用诱导的ROS维持mPTP上的二硫键交联和氧化游离巯基,打开mPTP,造成线粒体膜电位耗散;与哺乳动物mPTP相比,热带念珠菌mPTP没有凋亡调控因子BAX和Bcl-2基因,含有CyPD,VDAC和ANT基因。
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