目的有机磷化合物(organophosphorus compounds, OPs)应用广泛,主要用作农药、增塑剂、阻燃剂、油料添加剂、润滑剂及神经毒剂等。OPs除导致急性中毒外,还会引发迟发性神经病(organophosphate-induced delayed neuropathy, OPIDN)。该病一般发生于急性中毒恢复后,潜伏期为2周左右,主要是以中枢神经系统中长传导束路和外周神经系统的长神经中轴突退行性变为主要特征,会导致感觉、运动的异常改变。临床上尚无特效治疗方法,主要是对症支持治疗,预后差。目前其发病机制尚不清楚,但从其超微结构上能观察到神经丝(neurofilaments, NFs)、微管等在轴突聚集和滑面内质网增生等异常改变。本实验室前期研究了磷酸三邻甲苯酯(tri-ortho-cresyl phosphate, TOCP)诱导OPIDN母鸡神经系统中NFs在21d的变化,但整个OPIDN发生发展过程中NFs如何变化尚无研究。鉴于以前研究表明,对母鸡一次性灌胃750mg/kg TOCP前24h注射60mg/kg苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)能起保护作用。本实验以此为切入点,通过建立TOCP诱导的母鸡OPIDN模型和PMSF阻断OPIDN模型观察在0,1,5,10,21d不同时间点中枢神经中NFs亚单位含量变化,研究NFs在OPIDN进程中所起的作用。并在此基础上,通过研究上述两种模型中钙激活的中性蛋白酶(Ca2+-activated neutral protease, calpain)途径和周期蛋白依赖性的蛋白激酶5 (cyclin dependent kinase 5, CDK5)介导NFs磷酸化和NFs降解的变化,揭示TOCP诱导NFs异常的原因,探讨OPIDN的发病机制,为其治疗和预防提供基础资料。方法1. TOCP诱导母鸡OPIDN动物模型和PMSF阻断OPIDN动物模型的建立：成年罗曼母鸡适应性饲养7天后,随机分为TOCP组和PMSF+TOCP组,每组分为0d(即正常对照组)、1d、5d、10d、21d 5个时间点(n=8), PMSF按0.1 ml／kg的剂量(即60mg/kg)一次性皮下注射PMSF+TOCP组的动物,24h后,给予TOCP组和PMSF+TOCP组的实验动物一次性经口灌胃750mg/kg TOCP,正常对照组给予等体积生理盐水。密切观察实验动物染毒前后一般状况的变化,测量体重,观察其OPIDN症状并按8级评分标准进行评价(0,正常行走；1-2,间或的双腿运动轻微不协调；3-4,明显的双腿运动中度不协调；5-6,严重的、频发的站立和行走困难；7-8,双腿完全瘫痪)。在相应时间点处死各组动物,迅速取出大脑和脊髓,置于液氮中,-80℃保存。2.中枢神经组织中NFs3种亚单位含量的测定：取母鸡大脑和脊髓组织加入预冷的匀浆缓冲液(1% Triton X-100,50mM Tris-HCl, (pH 7.5),25mM KCl,2mM MgCl2,5mM EGTA,5mM DTT, Protease Inhibitor Cocktail (0.5μl/mg protein),磷酸酶抑制剂(5mM Na3VO4, 10mM Na4P2O7和1mM碘乙酸))制备匀浆,100,000g、4℃离心60min,分离出上清和沉淀两种组份。利用SDS-PAGE和Western-blotting技术分别测定神经组织匀浆后上清和沉淀两种组份中高分子量神经丝(high molecular neurofilament, NF-H),中分子量神经丝(medium molecular neurofilament, NF-M)和低分子量神经丝(low molecular neurofilament,NF-L)3种NF蛋白的含量。3.中枢神经组织中calpain活性测定：将大脑和脊髓组织分别剪碎后按质量体积比1：10加入匀浆缓冲液(10mM NaHCO3,5mM NaN3,15mM Tris-HCl,pH6.8),2000转／分,上下匀浆20次,10,919g、4℃离心20min,取上清150μl,加入1ml的反应缓冲液(145mM NaCl, 100mM Tris-HCl, pH 7.3),37-C水浴箱中孵育10min,再加入150μl的500gM的calpain substrateⅡ,在37℃水浴箱中振荡60min后取出1ml加入比色皿,在荧光分光光度计上用波长360nm的光线激发后,测定在440nm处发射的荧光强度。4.中枢神经组织中CDK5含量的测定：取大脑和脊髓组织,按质量体积比1：4加入匀浆缓冲液(50mM Tris-HCl (pH7.4),150mM NaCl, 1mM MgCl2, 5mM EGTA,2mM EDTA, 1mM PMSF, Protease Inhibitor Cocktail (0.5μl/mg protein)),制备组织匀浆,14,000转／分,4℃离心15min,取出上清,利用SDS-PAGE和Western-blotting技术测定大脑和脊髓中CDK5的含量变化。结果1.实验动物一般状况变化TOCP组动物染毒后未观察到急性中毒症状,约从第5d开始出现肢体活动减少,轻微的步态不平衡,之后步态失调逐渐加重,走路摇摆、跌跤,继之行走困难,15天内完全瘫痪,此状态持续至实验结束,体重呈下降趋势；PMSF+TOCP组动物未见明显OPIDN症状,体重变化不明显。2.实验动物中枢神经组织中NFs含量变化2.1实验动物大脑中NFs含量变化TOCP染毒后母鸡大脑中NFs含量明显改变,且在沉淀中比在上清中变化更明显。总的趋势是从第1d开始降低,第10d达到最低,第21d有所恢复。大脑沉淀中NF-L、NF-M和NF-H在第10d分别降低了86.2%(P<0.01),87.0%(P<0.01),54.1%(P<0.05)。提前24h给予PMSF后,与正常对照组相比较,大脑上清和沉淀中NF-L和NF-M均无明显变化,NF-H有所增加,其在沉淀中第5d增加最多达89.4%(P<0.01)。沉淀中PMSF+TOCP组NF3个亚单位比TOCP组在各时间点均有不同程度的增加。2.2实验动物脊髓中NFs含量变化TOCP染毒后母鸡脊髓组织上清和沉淀中NFs含量均明显改变。与正常对照相比,沉淀中3种NF亚单位的含量表现为先降低后恢复,均在10d时达到最低,差异有统计学意义(P<0.01),这与大脑中变化相似。上清中3种NF亚单位的变化趋势与沉淀基本一致,均在染毒后10d出现显著降低,到21d时恢复到正常水平。其中,10d时NF-L、NF-M和NF-H的含量降低幅度分别达到50.9%、86.4%和37.9%,差异有统计学意义。提前24h给予PMSF再染毒TOCP的母鸡在21天观察时间内脊髓中NFs紊乱明显减轻。与正常对照相比,脊髓样品匀浆离心后的沉淀中只有NF-M在第21d增加了35.1%(P<0.05),其余变化无统计学意义；上清中只有NF-H和NF-M在21d增加了14.6%和28.9%(P<0.05),其余变化均无统计学意义。3.实验动物中枢神经中calpain活性与正常对照组相比,TOCP单独染毒后母鸡大脑中calpain活性在第1、5、10和21天分别增加26.4%(P<0.05)、29.0%(P<0.01)、38.5%(P<0.01)和23.0%(P<0.05),差异有统计学意义；脊髓中calpain活性在各时间点分别增加11.2%、52.3%(P<0.01)、85.8%(P<0.01)和103.3%(P<0.01),差异均有统计学意义。提前24h给予PMSF组,除10d外,脊髓中calpain活性基本恢复正常；与正常相比,大脑中其活性反而增加很明显,第1、5、10和21天分别增加104.4%(P<0.01)、70.9%(P<0.01)、149.1%(P<0.01)和112.5%(P<0.01)。4.实验动物中枢神经中CDK5和p35变化与正常对照相比,TOCP组CDK5在大脑中呈现先减少后恢复的趋势,1d开始减少,5d降到最低,减少了28.9%(P<0.05),21d恢复至正常水平；在脊髓中呈增加趋势,10d和21d分别增加了46.6%(P<0.01)和42.9%(P<0.05)。p35在大脑和脊髓中变化一致,呈增加趋势,大脑中在5d、10d、21d分别增加了41.4%(P<0.05)、78.8%(P<0.01)和96.9%(P<0.01)脊髓中在10d和21d增加明显,分别为54.2%(P<0.01)和52.9%(P<0.01),其余无统计学差异。PMSF+TOCP组CDK5和p35的异常改变明显减轻。CDK5在大脑和脊髓中变化趋势与TOCP组相似,但无统计学意义；p35含量只有在大脑中10d和21d分别增加了42.6%和51.0%(P<0.05),其余无统计学意义。结论1.经口灌胃750mg/kg TOCP后母鸡出现共济失调,站立困难,最终瘫痪；提前24h注射60mg/kg PMSF再给予750mg/kg TOCP的母鸡未出现明显OPIDN症状,研究证实了提前应用PMSF能有效阻断OPIDN的发生。2. TOCP染毒母鸡大脑和脊髓组织中NFs含量都出现紊乱。提前给予PMSF在有效阻断OPIDN的同时,显著抑制了中枢神经组织中NFs的紊乱。结果提示TOCP诱发的NFs紊乱参与了OPIDN的发生。3. TOCP导致母鸡大脑和脊髓中calpain过度激活,PMSF预处理仅能抑制脊髓中calpain活性,结果表明calpain途径可能参与了TOCP诱导的脊髓中NFs降解,大脑的NFs降解可能与calpain无关。4. TOCP染毒引起母鸡中枢神经系统中CDK5/p35表达升高,提前应用PMSF能抑制其异常表达,提示CDK5途径的激活参与了TOCP导致的NFs稳态失衡。