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目的:观察大孔明胶可降解微球(Cutispher G)在微重力旋转培养条件下扩增人骨髓间充质干细胞对细胞增殖及特性的影响;检测增强酶解法提取的猪皮质骨胶原的生物相容性,制备其凝胶液并与细胞-微球复合构建工程组织,成骨诱导培养后观察该工程组织的成骨效果。方法:1、采用自建的“增强酶解技术”从猪骨中提取骨胶原,制备凝胶液并冻干为胶原膜,与hMSCs共培养,观察细胞在骨胶原膜中的生长情况;植入兔体内,观察组织相容性及体内降解情况;利用胶原涂层β-TCP支架,观察其对细胞上架及上架细胞的影响。2、体外分离hMSCs,扩增至第2代后分为两组。实验组收集1×10~7个细胞与预处理后的0.25g CultiSpher G均匀混合后加入容积为50ml的高截面纵横比容器内,加入培养基及血清,在旋转细胞培养系统上进行体外动态培养。对照组则按检测需要的比例,继续静止培养。不同时相点取材行甲基紫、MTT染色或固定后切片HE染色,观察细胞在微球的分布情况;于培养后1、2、3周取样,行扫描电镜观察;连续2周,每天从两种方法培养的细胞中取样行细胞计数、MTT检测,观察细胞的增殖情况;在培养第5d和第7d分别从两组细胞中取样,行细胞周期和细胞表面标志CD34、CD29检测,判定RCCS培养方式对培养细胞性质有无影响。3、将扩增后的细胞-微球复合物按细胞浓度1×10~5/ml与冰浴状态下的胶原凝胶液均匀混合,中性、37℃条件下凝胶液固化,完成组织构建,同时制备单纯的细胞-凝胶复合物作为对照,随培养时间延长观察两种组织外观及质地变化。4、利用上述凝胶固化法制备组织工程骨作为实验组,同时以DBM为支架,常规静止接种法构建组织工程骨作为对照组,行成骨诱导培养,倒置显微镜下观察组织中细胞形态、分布情况,并在不同时相点取材,测定DNA含量、碱性磷酸酶活性(ALP),定量评定hMSCs增殖、成骨分化效果。结果:1、胶原膜细胞复合培养,无明显细胞毒性表现,hMSCs增殖迅速,生长无受抑表现;2、兔体内埋植试验,无明显毒性反应,胶原膜1周时即明显降解,2周左右完全吸收;3、胶原作为β-TCP涂层材料使接种效率由46.95%提高到60.60%,且上架的细胞活性恢复迅速,增殖较未处理组快(P＜0.05);4、RCCS培养,接种24h,显微镜下观察大部分细胞贴附于微球表面,随培养时间延长细胞数量增多,并分泌大量基质,将多个微球裹在一起;甲基紫、MTT染色提示微球上细胞随培养时间延长数量逐渐增多,固定后切片HE染色可见大量细胞贴附于微球表面,并有部分细胞长入微球孔隙中;5、MTT检测及细胞计数提示利用RCCS培养hMSCs:对数生长期由静止培养的3d延长到6d,生长高峰时收获细胞总量由静止培养获得接种量的3.17倍增加为10.75倍;6、细胞周期检测两种方法无明显差别,大部细胞处在G1期;表面标志检测两种方法培养的细胞均保持了良好的干细胞特性,CD34阴性表达,CD29阳性表达;7、骨胶原凝胶液在中性、37℃环境中约10min固化,倒置显微镜观察,构建后2h细胞从微球表面突起,24h后在凝胶中伸展,呈三维立体生长;8、大体观察,刚构建的组织块呈半固态胶状,柔软,易裂,表面光滑,随培养时间延长,组织块机械强度逐渐增强,表面开始皱缩,14d时韧如橡胶;构建24h后,复合物体积随细胞增殖开始缩小,14d天后对照组样本直径仅为原来的27.33%,而试验组为85.33%;9、两组复合物内DNA含量、ALP活性随培养时间延长增加显著,且实验组增速快于对照组(P＜0.05)。结论:1、增强酶解法提取的骨胶原具有良好的生物相容性和凝胶固化特性;2、CultiSpher G结合RCCS是体外规模化扩增hMSC的有效方法;3、细胞-微球复合骨胶原凝胶构建的组织,成骨诱导培养后具有一定的力学强度和成骨活性;4、细胞-微球复合骨胶原凝胶固化构建组织工程骨的方法具有避免消化收集种子细胞,接种效率高,操作简单等优点,是一条较为理想的组织工程骨构建技术路线。