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人胚胎干细胞（Human embryonic stem cell,hESC）来源于早期人类胚胎的内细胞团，它可以分化为内、中、外三个胚层的各种细胞及组织。胚胎干细胞的这些特点使得其在再生医学领域有巨大的应用潜能，但是在此之前，它仍然面临巨大的挑战，即安全性问题，主要包括遗传学及表观遗传学两方面的内容。有研究证实，人胚胎干细胞（hESC）具有极度倾斜性X染色体失活（X chromosomeinactivation,XCI）现象，而某些基因组失衡且表观异常疾病（如X染色体连锁智力发育迟缓类疾病）也表现极度倾斜的XCI。本课题组前期课题也发现，倾斜性XCI的hESC存在DNMT、Nanog等基因区域微小基因组失衡。于是我们推测，除了DNA甲基化及组蛋白修饰外，基因组水平的微小失衡与hESC倾斜性XCI可能也有相关性。本研究利用微阵列单核苷酸多态性技术对9株hESCs基因组稳定性检测，发现了一些胚胎干细胞基因组存在拷贝数变异（copy numbervariation,CNV）及杂合性缺失（loss of heterozygosity,LOH）。结合对9株hESCs中X染色体失活状态分析发现，hESC中X染色体倾斜性失活可能与基因组CNV/LOH区域涉及的某些基因功能改变有一定的相关性，并通过生物信息学分析预测可能的调控通路。研究目的本课题以hESC为研究对象，结合微阵列单核苷酸多态性技术等方法，对hESC基因组稳定性进行检测，并在全基因组内寻找与X染色体倾斜性失活高度关联的拷贝数变异（CNV）、杂合性缺失（LOH），筛选出候选基因，明确基因组失衡影响X染色体倾斜性失活的可能机制，丰富干细胞遗传安全性及表观遗传调控机制的理论。研究方法1．利用本实验室前期建立的10株hESCs系，复苏并体外培养传代。进行hESC表面抗原SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81等染色鉴定。2．10株hES培养至10代左右，收集细胞，提取基因组DNA。3．对各细胞DNA进行人雄激素受体基因（HUMARA）多态性片段分析，判断其杂合性，选择HUMARA基因杂合子进行X染色体失活分析。4．使用EpiTect Bisulfite Kit试剂盒(QIAGEN)，将基因组DNA进行用重亚硫酸盐处理,随后行引物特异性PCR反应，并对产物进行多态性片段分析。5．利用微阵列单核苷酸多态性技术，分别检测随机失活组及倾斜性失活组hESCs细胞提取的基因组DNA，寻找与X染色体倾斜性失活可能相关的CNV/LOH。6．利用UCSC、NCBI及DECIPHER等数据库，分析相关CNV/LOH关键区域可能与X染色体倾斜性失活相关的基因，进一步探索可能的基因调控通路。7．分别选取2株X染色体倾斜性失活及随机失活的hESCs，细胞提取RNA，利用荧光定量PCR对倾斜组胚胎干细胞基因组LOH区域涉及的4个lncRNA即XIST,TSIX, JPX, FTX表达情况进行检测分析。实验结果1.10株hESC系均具有典型的hESC克隆形态，表达hESC细胞表面抗原SSEA-4,SSEA-3,TRA-1-60,TRA-1-81。2.核型分析，9株为正常核型的女性hESCs,1株为正常核型的男性hESC。3.9株女性hESC细胞HUMARA位点均为杂合子。4.对9株HUMARA位点杂合子的hESC进行XCI倾斜性失活分析，4株为倾斜性失活，5株为随机失活。5.通过对9株hESCs全基因组行基因芯片检测，发现hESC基因组存在CNV及LOH。通过软件分析发现，本研究的9株hESC在1,4,9,10,12,13,15,17,18,20,21,22这12个染色体上未发现大于400kb的CNV存在。6. X染色体倾斜性失活组hESC与随机失活组CNV数量及大小合计无统计学差异。7. X染色体倾斜性失活组hESC基因组的CNV涉及的基因有：KDM6A，FUNDC1, DUSP21, GAMT。8. X染色体倾斜性失活组hESC基因组的LOH涉及的基因有:HDAC8,XIST,TSIX, JPX, FTX。9. X染色体倾斜性失活的2株hESCs XIST表达比随机失活组高，JPX表达比随机失活组更少，其他2个lncRNA即TSIX,FTX表达在两组之间未见明显差异。10. hESC基因组的LOH区域涉及很多miRNA。研究结论1.微阵列单核苷酸多态性技术是研究hESC全基因组稳定性的一个高敏感技术,hESC基因组并不稳定，存在CNVs和LOH。2.利用HUMARA的甲基化特异性PCR是研究hESC X染色体失活状态的一个经典方法，hESC确实存在倾斜性失活情况。3. hESC X染色体倾斜性失活与基因组CNV的数量、总的变异大小及染色体分布无关，而可能与CNV涉及的基因KDM6A，FUNDC1, DUSP21, GAMT有关。lncRNA如XIST的LOH可能诱发X染色体倾斜性失活，JPX的LOH则可能负调控X染色体的倾斜性失活。miRNA在hESC X染色体倾斜性失活中可能发挥调控作用。4. hESC X染色体倾斜性失活是多因素共同作用的结果，基因组微失衡及甲基化改变等，不同株系hESC X染色体倾斜性失活的诱发因素可能不同。