肠道病毒71型(EV71)是引起婴幼儿重症手足口病的主要病原体,其感染可导致严重的神经性疾病,包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎和神经性肺水肿等。近年来大规模发生的手足口病疫情,严重危害婴幼儿、尤其是农村地区幼儿的身体健康,给公共卫生的发展带来巨大挑战。EV71属于小RNA科病毒,报道表明小RNA病毒科病毒利用宿主细胞的内膜系统进行自身基因组的复制。病毒感染导致细胞内膜系统发生改变,富集病毒复制所需因子,形成不同于细胞内膜的膜结构,包含不同的蛋白组分和脂质组分,即病毒复制中心。病毒利用复制中心的宿主因子和病毒自身蛋白完成复制。最初报道表明高尔基体蛋白GBF1和ARF1在病毒复制中发挥重要作用。近年来发现,ACBD3介导嵴病毒3A蛋白募集病毒复制重要蛋白PI4KB至病毒复制中心。多种肠道病毒的3A蛋白也可以与ACBD3相互作用,但这种相互作用在不同病毒复制中的作用和机制不同,如柯萨奇病毒和鼻病毒的3A可以与ACBD3结合,但ACBD3并不参与二者的复制。目前,有关ACBD3在肠道病毒复制中的作用仍存在争议。我们前期通过酵母双杂交发现EV71的3A蛋白能与ACBD3相互作用。因此,本课题围绕ACBD3在EV71病毒复制中的作用和分子机制进行深入的研究,以期进一步阐明EV71的复制机制,发现潜在的抗病毒药物靶标,为病毒致病机理和抗病毒药物的设计研发提供理论依据。通过外源性共转染3A和ACBD3蛋白,验证了 ACBD3和3A的相互作用。进一步发现病毒感染后,EV71 3A也可以与内源性ACBD3共定位,并影响ACBD3在细胞内的分布。利用RNAi敲低ACBD3的表达,或是利用CRISPR/Cas9技术敲除ACBD3的表达后EV71病毒基因组的复制、蛋白的翻译及空斑形成能力均受到了抑制。而当回复ACBD3的表达后,病毒基因组的复制、蛋白的翻译及空斑形成能力又可以得到拯救。通过突变和免疫共沉淀定位了 ACBD3与3A相互作用的关键区域,发现ACBD3的C端在其与3A结合中起着关键作用,而3A的41-86AA在其与ACBD3结合中十分重要。同时我们通过点突变发现EV71 3A的第44位异亮氨酸和第54位的组氨酸是二者相互作用中的关键位点。以上结果说明,ACBD3通过与EV71的3A蛋白结合参与病毒复制。此外,参与EV71复制的另外一个重要分子是PI4KB,但在EV71复制中如何募集至复制中心还不是十分清楚。我们首先验证了 PI4KB是否参与EV71复制,发现PI4KB的抑制剂能抑制EV71病毒的复制,同时,利用RNAi技术敲低PI4KB的表达或是利用CRISPR/Cas9技术敲除PI4KB的表达后EV71病毒基因组的复制、蛋白的翻译及空斑形成能力均受到了抑制。进一步研究PI4KB募集至复制中心的机制,发现EV71 3A能够增强PI4KB与ACBD3间的相互作用,并且感染后三者均定位于病毒的复制中心,同时,EV71病毒感染细胞后能导致复制中心附近PI4P的量的增加,而这些过程均需要ACBD3的参与。分子筛层析实验发现,在EV71病毒感染细胞后,会形成一个含有ACBD3,PI4KB,EV71-3A及EV71-3D的大分子复合物。EV71-3A第44位及第54位氨基酸的突变同样会抑制ACBD3与PI4KB的结合。最后,我们发现ACBD3同样参与到EV68病毒的复制过程中,而对HRV16病毒的复制不起作用。上述实验结果说明,PI4KB参与EV71病毒的复制,并通过形成3A-ACBD3-PI4KB分子复合物的形式促进EV71及EV68病毒的复制,而HRV16的复制机制还需后续深入研究。该研究结果阐述ACBD3在肠道病毒复制过程中的作用机制。综上所述,本研究发现ACBD3通过与EV71病毒蛋白3A相互作用定位于病毒的复制中心,形成EV71-3A-ACBD3-PI4KB分子复合物的形式促进EV71复制,同时ACBD3参与了 EV68病毒的复制,但并不参与HRV16病毒的复制。本研究发现了 ACBD3参与EV71病毒及其他肠道病毒复制的机制,为阐明肠道病毒的致病和复制机制提供理论依据,为药物研发提供新的靶点。