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胃癌作为一种发病于胃窦部位上皮腺体细胞的恶性肿瘤,在世界范围内胃癌的流行病学特征主要表现为较高的发病率以及死亡率,早期病例确诊困难以及患者预后不良,对人们健康产生巨大威胁。而我国更是胃癌发病和死亡人数双高的中心区域,每年新增胃癌患者占全世界比例高达47.13%。目前临床上胃癌的治疗主要仍是沿用传统对胃部癌变部位进行手术切除,化放疗结合法以及针对酪氨酸或生长因子为靶标的靶向药物治疗,这些治疗方法普遍存在副作用大、靶向性差、价格高昂、易对患者造成二次创伤等缺点;此外临床应用的一线胃癌治疗药物由于具有较强的毒副作用,极大程度上限制了相关药物在临床方面的使用。所以,开发新型高疗效、低毒副作用的抗胃癌药物仍然是目前亟待解决的问题之一。针对胃癌治疗药物的开发其主体思路仍为抑制胃癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡及抑制癌细胞的转移。因此本项目旨在探讨紫云英苷对胃癌AGS细胞的生长增殖、诱导凋亡、细胞迁移的影响,并对紫云英苷作用的相关信号转导通路及ROS的内在关联进行深入研究。利用CCK-8比色法测定10种胃癌细胞及4种正常细胞在不同浓度及时间梯度下的细胞存活率。利用流式细胞术和蛋白质免疫印迹法检测胃癌AGS细胞周期分布和细胞周期相关蛋白表达情况。利用Hoechst/PI双荧光染色法观察细胞凋亡形态,流式细胞术及蛋白质免疫印迹法检测线粒体途径引发凋亡的蛋白变化情况。利用细胞划痕实验对胃癌细胞的迁移情况进行观察并计算相应的细胞迁移率。利用蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关信号通路(p38、JNK、ERK、NF-κB),细胞周期信号通路(Akt、p53、STAT3)以及细胞迁移信号通路(TGF-β/Smad)的蛋白表达情况,并且进一步对核转录因子NF-κB、STAT3的核内及胞质含量进行测定。通过ROS特异性荧光探针进行染色,测定其胞内含量;然后利用流式细胞术检测ROS与紫云英苷诱发的生物学活性的内在关联,并在基因及蛋白水平上说明ROS与凋亡及周期的关联性。紫云英苷对10种胃癌细胞均具有良好的杀伤作用,对正常肺部IMR-90、肾脏293T、肝脏L-02及胃GES-1细胞具有较低的毒性作用,并且与阳性对照药5-FU相比,紫云英苷对胃癌细胞具有更强的增殖抑制能力以及更低的毒副作用。紫云英苷通过上调CKI(p21及p27)的表达,使得Cyclin B1与CDK1/2的表达以及CDK/Cyclin的结合被显著抑制,导致胃癌AGS细胞发生G2/M期周期阻滞。紫云英苷通过上调线粒体膜蛋白Bad/Bcl-2比率,使线粒体膜的通透性上升,内容物渗出,线粒体膜的稳态平衡被破坏,从而使得下游的Caspase-3及其作用底物PARP受到剪切,从而导致胃癌AGS细胞通过线粒体途径发生凋亡。紫云英苷能够促进p-p53蛋白质的表达,抑制p-Akt和p-STAT3蛋白质的表达,此外受到抑制的Akt信号通路能够进一步抑制STAT3转录活性,使胃癌细胞发生周期阻滞。紫云英苷能够通过磷酸化抑制了 ERK信号通路,并激活了 p38和JNK信号通路,引起细胞质内κB-α(NF-κB结合蛋白)表达量上升,导致胞质及核内NF-κB的活性被抑制,从而引起胃癌细胞发生凋亡。紫云英苷通过促进抑制TGF-β1、Smad2/3、N-cadherin 和 Vinmentin 的表达,促进 E-cadherin 的表达抑制了胃癌细胞的迁移。紫云英苷通过其氧化还原活性,引起细胞内活性氧的蓄积,进而调控MAPK、Akt、p53、STAT3和NF-κB信号通路,从而参与调控细胞凋亡及周期。综上所述,紫云英苷通过上调细胞内ROS水平,激活了 MAPK信号通路进而抑制了下游NF-κB信号通路,使胃癌细胞通过线粒体途径发生凋亡;ROS的升高抑制了 Akt信号通路,激活了 p53信号通路,进而使其下游的STAT3转录因子活性受到抑制,使胃癌细胞发生G2/M期周期阻滞。此外紫云英苷通过下调TGF-β/Smad信号通路,阻滞了 EMT途径,从而使胃癌细胞的迁移受到抑制。