【摘 要】
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背景瘢痕疙瘩（keloid disease,KD）是皮肤损伤后伤口异常愈合的产物,因其常出现疼痛或瘙痒等感觉异常、影响美观和导致局部功能障碍等症状,对患者的生活质量影响严重。KD的形成机制尚不明确,目前的治疗方法效果有限且容易复发,因此需要探索新的治疗策略。微小RNA（micro RNA,miRNA）是一种短链非编码RNA,在体内调节多种基因的表达,随着对KD研究的深入,许多miRNA被证明是KD
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背景瘢痕疙瘩（keloid disease,KD）是皮肤损伤后伤口异常愈合的产物,因其常出现疼痛或瘙痒等感觉异常、影响美观和导致局部功能障碍等症状,对患者的生活质量影响严重。KD的形成机制尚不明确,目前的治疗方法效果有限且容易复发,因此需要探索新的治疗策略。微小RNA（micro RNA,miRNA）是一种短链非编码RNA,在体内调节多种基因的表达,随着对KD研究的深入,许多miRNA被证明是KD发病过程中的关键调控因子。Ⅲ型胶原蛋白α-1（CollagenⅢalpha-1,COL3A1）是胶原基因的一种,参与Ⅲ型胶原蛋白α-1链的编码,已被证明在KD中表达升高。本研究探索了miR-29a-3p和COL3A1在KD中的作用和初步机制。目的1.观察miR-29a-3p在瘢痕疙瘩组织中的表达情况;2.证明瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-29a-3p对COL3A1的靶向作用;3.观察miR-29a-3p对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的调控作用。方法1.收集临床确诊的瘢痕疙瘩患者的瘢痕组织28例及手术切除的正常皮肤组织15例,HE染色明确KD诊断,实时荧光定量逆转录PCR法（Quantitative reverse transcription-PCR,qRT-PCR）检测瘢痕组织及正常真皮组织中miR-29a-3p及COL3A1的表达水平。2.观察上调miR-29a-3p表达对KFBs的影响:向人瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid fibroblasts,KFBs）中转染miR-29a-3p mimic或miR-NC,通过qRT-PCR检测转染效果,CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡。3.证明miR-29a-3p靶向COL3A1:利用Targetcan预测miR-29a-3p的潜在靶基因COL3A1,用野生型报告基因载体（含有pmir GLO-Wt-COL3A1 3’UTR）或突变型报告基因载体（含有pmir GLO-Mt-COL3A1 3’UTR或pmir GLO-M1t-COL3A1 3’UTR或pmir GLO-M2t-COL3A1 3’UTR）分别与miR-29a-3p mimic或miR-NC共转染KFBs细胞,利用双荧光素酶报告实验和Western Blot验证miR-29a-3p与COL3A1之间的靶向关系。4.通过rescue实验检测过表达COL3A1对上调miR-29a-3p的KFBs细胞效应的影响:用miR-NC或miR-29a-3p mimic或miR-29a-3p mimic+pc DNA3.1-COL3A1分别转染细胞,Western Blot检测各组细胞COL3A1表达,利用CCK-8法和流式细胞术,观察过表达COL3A1逆转上调miR-29a-3p对KFBs细胞增殖和凋亡的影响。结果1.与正常组织相比,瘢痕疙瘩组织中miR-29a-3p表达水平显著降低（P＜0.01）,COL3A1表达水平显著升高（P＜0.01）;2.qRT-PCR和Western Blot结果显示:转染miR-29a-3p mimic后的细胞,miR-29a-3p表达显著升高,COL3A1蛋白表达显著减少（P＜0.01）,CCK-8法和流式细胞术显示:上调miR-29a-3p表达后,抑制了KFBs的细胞增殖,促进细胞凋亡（P＜0.01）。3.生物信息学分析表明miR-29a-3p与COL3A1的3’UTR存在两个结合位点。双荧光素酶报告实验结果表明:当野生型报告基因载体与miR-29a-3p mimic共转染KFBs细胞时,荧光素酶活性受到明显抑制（P＜0.01）,而含有pmir GLO-Mt-COL3A13’UTR或pmir GLO-M1t-COL3A1 3’UTR或pmir GLO-M2t-COL3A1 3’UTR的突变型报告基因载体与miR-29a-3p mimic共转染细胞时,荧光素酶活性变化无统计学差异,28例瘢痕疙瘩组织中Pearson相关性分析结果显示miR-29a-3p与COL3A1的表达水平呈显著负相关。4.与转染miR-29a-3p mimic组KFBs细胞相比,miR-29a-3p mimic+pc DNA3.1-COL3A1组细胞增殖活力显著升高,凋亡率降低（P＜0.05）;与转染miR-29a-3p mimic组KFBs细胞相比,miR-29a-3p mimic+pc DNA3.1-COL3A1组miR-29a-3p表达无明显差异（P＞0.05）。结论1.瘢痕疙瘩组织中miR-29a-3p显著低表达;2.瘢痕疙瘩成纤维细胞中miR-29a-3p靶向负调控COL3A1的表达;3.过表达miR-29a-3p靶向COL3A1抑制KFBs细胞增殖、促进凋亡。
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